色谱法薄层色谱和柱色谱.ppt

有机化学实验,色谱法（薄层色谱、柱色谱）,一.实验目的,学习薄层色谱和柱色谱技术的原理和应用；掌握用薄层色谱和柱色谱分离和鉴定化合物的操作技术。,二.实验原理和实验技术,色谱法：分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。,色谱法基本原理：利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。,流动的体系称为流动相（气体或液体）；固定不动的物质称为固定相（可以是固体或液体）。,根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等；,根据操作条件不同，可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。,二.实验原理和实验技术,薄层色谱（TLC，薄层层析）,薄层吸附色谱的工作原理：,特点：所需样品少，分离时间短，效率高。,应用：精制样品，鉴定化合物，跟踪反应进程和柱色谱的摸索最佳条件等。,组分,固定相,流动相,吸附剂（固定相）,展开剂（流动相）,样品点（多组分）,吸附竞争,斑点的最高浓度中心至原点中心的距离,展开剂前沿至原点中心的距离,比移值Rf：,比移值Rf 在一定条件下和溶质（组分）的分子结构、性能有关，不同的溶质在色谱分离过程的比移值是不同的。但对同一溶质在相同条件下进行色谱分离时，比移值是一个特定的常数（定性分析的依据）。,由于吸附剂（硅胶、氧化铝等，强极性）对样品中各组分吸附能力不同（极性强的组分被吸附能力越强），当展开剂（常常是具有一定极性的有机溶剂）流经吸附有样品的吸附剂时，展开剂与样品中的各组分对吸附剂产生竞争吸附，极性小的组分从吸附剂上解吸较易，随展开剂较快地移动；极性大的组分从吸附剂上解吸较难，随展开剂移动较慢。,二.实验原理和实验技术,薄层色谱（TLC，薄层层析）,固定相的选择：,硅胶和氧化铝是薄层色谱常用的固定相，两者都属于极性吸附剂。,硅胶的型号：60G、600GF254、60H、60HF254和60HF254+366等,薄层吸附色谱（固定相为极性吸附剂）中，化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较强极性的化合物吸附较强，即Rf 值较小。,无机盐、离子型有机物,磺酸、羧酸,醇、酚、胺,醛、酮、酯,卤代烃、醚,芳香烃,烯,环烷烃,烷烃,常见有机化合物的极性大小：,硅胶：（吸附性）表面的Si-OH基（应用）分离酸性、中性有机物,氧化铝：（吸附性）铝原子上未成键的电子对（应用）分离碱性、中性有机物,二.实验原理和实验技术,薄层色谱（TLC，薄层层析）,展开剂的选择：,选择展开剂时，要考虑样品各组分的极性、溶解度和吸附活性等因素。,常用展开剂的极性大小顺序（仅对硅胶和氧化铝适用）：,一般情况下，溶剂的展开能力与溶剂的极性成正比。,溶剂的极性大,溶剂对化合物的解吸能力强,Rf 值大,己烷、石油醚 环己烷 四氯化碳 三氯乙烯 二硫化碳 甲苯 苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 四氢呋喃 乙酸乙酯 丙酮 正丁醇 丙醇 乙醇 甲醇 水 冰乙酸 吡啶 乙酸,如果单一展开剂分离效果不显著，可选用混合溶剂。,环己烷乙酸乙酯混合溶剂（）,二.实验原理和实验技术,柱色谱,吸附柱色谱的工作原理：,在色谱柱中填入表面积很大、经过活化的多孔性粉状固体吸附剂（硅胶、氧化铝）。分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带。再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集。,二.实验原理和实验技术,柱色谱,吸附剂的选择：,常用的吸附剂：氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。,吸附剂要求：不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用；吸附剂的粒度大小要均匀。,粒度小，表面积大，吸附能力强，分离效果好，但流速慢；粒度大，表面积小，吸附能力弱，分离效果差，但流速快。,氧化铝：酸性（分离酸性物质，如有机酸类化合物）中性（分离中性物质，如醛、酮、醌和酯类化合物）碱性（分离碱性物质，如碳氢化合物、生物碱、胺等）,本实验吸附剂：中性氧化铝（150目）,二.实验原理和实验技术,柱色谱,溶剂、洗脱剂的选择：,选择原则：取决于样品各组分的极性；极性小的组分用极性小的洗脱剂进行洗脱；极性大的组分用极性大的洗脱剂进行洗脱。,极性大的洗脱剂对极性大和小的组分洗脱能力都很强。,除单一溶剂外，也可采用混合溶剂，或采用梯度（开始是低极性溶剂，后面是高极性溶剂）,最终选择：根据各组分的极性，采用TLC技术确定。（在TLC中能使各组分分开的展开剂即可做为柱色谱的洗脱剂。）,二.实验原理和实验技术,薄层色谱和柱色谱,相同点：薄层色谱和柱色谱都属于液固吸附色谱，都是经过在吸附剂和展开剂（洗脱剂）之间的多次吸附溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，实现混合物的分离。,不同点：,薄层色谱：是将吸附剂涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动。,柱色谱：是将吸附剂装于柱中，当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，从而达到分离的目的。,三.实验装置,薄层色谱,柱色谱,层析缸,薄层板,层析柱,四.实验步骤,薄层色谱,（1）薄层板的制备：（略）,（2）点样：,取出制好的薄层板，分别在距一端lcm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。取管口平整的毛细管插入样品溶液中，在一块板的起点线上点5%间硝基苯胺的苯溶液、1%的偶氮苯的苯溶液和1%苏丹的苯溶液三个样点。在第二块板的起点线上点混合液及未知物A/B两个样点，样点间相距约1.5cm左右。如果样点的颜色较浅，可重复点样，重复点样前必须待前次样点干燥后进行。样点直径不应超过2mm。,间硝基苯胺,偶氮苯,苏丹,点样用的毛细管必须专用，不得弄混。,使毛细管液面刚好接触到薄层板即可，切勿点样过重而使薄层破坏。,用无水环已烷乙酸乙酯混合溶剂为展开剂。在层析缸中放约15mL的展开剂，盖上盖子使容器被展开剂蒸汽饱和分钟左右，然后把薄层板小心放入层析缸内。点样一端应浸入展开剂约0.5cm。盖好盖子，观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm处取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，晾干后观察分离的情况，比较三者Rf值的大小，并根据Rf判断出未知物中所含的组分。,（3）展开：,原点（点样线）勿浸入展开剂中！,动作要快！否则溶剂前沿很快消失。,当溶剂液面下降至与滤纸面相近时(勿使滤纸变干)，关闭活塞，用长的滴管将上述混合液小心加入柱顶，打开活塞，当液面下降与滤纸相近时，关闭活塞，再小心加入2mL95%乙醇，重复上述操作两次，然后小心加入足量95%乙醇，打开活塞，使滴下速度为12滴/秒。蓝色的亚甲基蓝首先向柱子下端移动，甲基橙则留在柱子上端。当蓝色的亚甲基蓝快从柱子里流出时，更换一个接受器立即计量收集(用量筒)。继续洗脱，至滴出液体近无色为止（即蓝色液全部流出后），再换一接受器，改用水洗脱至橙色的液体开始滴出，用另一接受器计量收集被洗脱甲基橙水溶液，直至无色为止。这样两种组分就被分开了。实验结束后，将氧化铝从柱顶倒置倒出，把柱子洗净归还。,四.实验步骤,（1）装柱（湿法）,安装好色谱柱（垂直），以50mL锥形瓶作洗脱液的接受器。向柱内倒入95%乙醇至柱高3/4处，打开活塞，控制滴出速度为l滴/秒，收集滴下的溶剂，通过干燥的长颈玻璃漏斗慢慢加入15g中性氧化铝。用橡皮塞或手指轻轻敲打柱身，使填装紧密均匀，不断补充乙醇（收集的），勿使氧化铝柱层变干，让溶剂保持流动一段时间，至氧化铝顶部不再下降，将一张内径略小滤纸盖在氧化铝层顶部，以保护氧化铝层平面。,（2）展开和洗脱,取甲基橙和亚甲基蓝溶液各4滴于一小试管内，混匀备用。,柱色谱,若松紧不均，特别是有断层时，影响流速和色带的均匀，但如果装柱时过分敲击，色谱柱填装过紧，又使流速太慢。,甲基橙,亚甲基蓝,当柱内溶剂或溶液液面流至固体中，就会使柱身干裂，影响渗滤和显色的效果。,滴管尽量接近滤纸慢慢滴加入，以避免将氧化铝溅起。,