醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量.ppt

,实验五 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量,目的,学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和方法 学习蛋白质染色的方法 了解电泳法分离血清蛋白质的临床意义,原 理,1、电泳（electrophoresis）法在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子带电荷的蛋白质，在电场中将向着与其所带电荷电性相反的电极泳动这种现象称为电泳。,电泳影响因素,蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质、数量及质点的大小和形状；此外还受外界因素的影响如，电场强度、溶液的PH、离子强度及电渗等。常见的有：醋酸纤维膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳,醋酸纤维薄膜电泳,醋酸纤维薄膜作为支持介质 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.10.15mm,血浆蛋白：,(1)清蛋白（Alb）、1、2、纤维蛋白原和-球蛋白;(2)血浆中蛋白质的PI小于7.0，在PH8.6 Buffer中解离成负离子，在电场中向正极移动。(3)在同一pH下所带电荷量多少有差异，各蛋白质的分子大小与分子形状也不相同，因而在同一电场中泳动速度不同。,染色剂,一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽春红 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色,白蛋白 a1-球蛋白 a2-球蛋白-球蛋白 球蛋白醋酸纤维薄膜法显示血清蛋白质从阳极端起依 次为白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、-球蛋白 和球蛋白五条区带。,定量,与蛋白质结合的染料可溶解于碱液，溶液颜色深浅与蛋白质量呈正比 比色法比较各蛋白质条带溶于碱后的溶液颜色，可计算出各种蛋白质所占的百分比,计算,OD总和 T A+1+2+白蛋白 A/T 100 1球蛋白 1/T 100 2球蛋白 2/T 100 球蛋白/T 100 球蛋白/T 100,操 作,1、准备（1）电泳仪的准备（2）薄膜的准备：在薄膜无光泽面标记点样位置 将薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡,2、点样,（1）无光泽面朝上，吸去多余Buffer,（2）用盖玻片蘸取少量血浆，垂直印在划线 处。注意：不能超出边缘；不能重复点样；必须与边缘平行要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜。,3、平衡：无光泽面朝下，点样侧位于阴极（5min)4、电泳：打开电源，U160V或I1.6mA t=4550min；冬季1小时 5、染色：氨基黑10B 染色充分，510min 6、漂洗：34个漂洗皿，洗去染料至背景无色。,临床意义,血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为6080g/L，绝大部分由肝脏合成，仅球蛋白由浆细胞合成 正常值：白蛋白5772 1球蛋白25 2球蛋白49 球蛋白6.512 球蛋白1220,血浆蛋白的主要功能 维持血浆胶体渗透压 调节血浆pH值，维持酸碱平衡 运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等 免疫作用,肝炎：白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、-球蛋白下降，球蛋白升高 肝硬化：白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白下降明显，球蛋白极度升高 肾病综合症：白蛋白降低，2和球蛋白升高 临床检测：,