酶的分离纯化与制剂.ppt

1,第三章 酶的分离纯化与制剂,1,2,酶分离纯化的目的,酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。,3,1926年Sumner制备了第一个结晶酶，自此以后，酶的分离纯化工作进展很快。到现在已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净。并且根据酶的作用特点、物理化学性质等发展了各种类型的分离纯比方法、试剂和设备，但是，由于酶和它的来源不同，也由于与之共存的高分子物质的复杂多样，因此要使一种酶达到高度纯净，往往需要多种方法协同发挥作用才有可能。,2,4,酶分离的一般流程,5,6,第一节 酶分离纯化工作的基本原则,。,3,分离纯化过程包括3个基本步骤：1 抽提2 纯化3 制剂,7,也就是说整个工作包括三个基本环节：,抽提(extraction)是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；纯化(purification)是要将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；制剂(Preparation)是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。为了能够成功地进行酶的分离纯化，应注意以下问题,8,1防止酶变性失效(denaturation-deactivation),防止酶的变性失效是酶的分离纯化工作中非常重要的问题，这一点在纯化的后期尤为突出。一般地说，凡是用以预防蛋白质变性失效的方法与措施都应考虑用于酶的分离纯化工作。包括：(1)除了少数例外，所有操作都必须在低温条件下进行，特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心；(2)大多数酶在pH10的情况下不稳定，应控制整个系统不要过酸、过碱同时要避免在调整pH时产生局部酸碱过量；,4,9,1防止酶变性失效(续),(3)酶和其他蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作时要尽量减少泡沫形成；(4)重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在都能使酶分解破坏，所有这些必须高度重视。,10,酶不可逆失活的原因和机理,11,蛋白质不可逆失活的原因,蛋白酶水解或自溶作用,表面活性剂和去垢剂,聚合作用,氧化作用,机械力,变性剂,重金属离子和巯基试剂,冷冻和脱水,热,极端pH,蛋白质不可逆失活,脲和胍,高浓度盐,螯合,有机溶剂,辐射作用,12,蛋白质的稳定化,蛋白质稳定化途径,如何防止蛋白质的可逆伸展,如何防止蛋白质不可逆失活反应发生,13,稳定蛋白质（酶）的方法,14,2选择有效的纯化方法,理论上，凡用于蛋白质分离纯化的一切方法都同样适用于酶，但实际上，对于酶的分离纯化来说，它还有更大的选择余地。因为：(1)酶纯化的最终目的是要将酶以外的一切杂质(包括其他酶)尽可能地除去，因而，容许在不破坏待纯化的“目的酶”的限度内，使用各种“激烈”手段。(2)由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性，因此可应用各种亲和分离法；而且，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性往往会发生一些有利的变化，这样又扩大了纯化方法与纯化条件的选择范围。,5,15,3酶活性测定贯穿纯化过程的始终,应贯穿于整个纯化过程的酶活性测定始终。酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。也就是说，从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较，这样，我们就能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么条件，它们分别使酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而决定其取舍。,6,16,第二节 酶的抽提,抽提的要求是要将尽可能多的酶、尽量少的杂质从原料引入溶液。抽提包括以下环节:,7,17,一、预处理和破细胞,材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶酶和晶酶）。,18,微生物胞外酶 可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥胞内酶 要先收集菌体，经细胞破碎后提取,19,动物材料 应先剔除结缔组织和脂肪组织等植物材料 应去皮等以免单宁等物质着色污染,20,酶，根据它的分布可分为细胞内酶(intracellular enzyme)和细胞外酶(excellular enzyme)。,细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题；而细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。“周质酶”(Periplasmic enzyme)通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就可释放。“膜结合酶”(membrance-binding enzyme)则往往还有一个切断酶与颗粒体或膜的连结问题；有些情况下，蛋白质或酶在合成以后，以无活性的状态作为“包含体”(inclusion body)形式积累，在分出包含体后还有一个蛋白质复性的问题。,8,21,破细胞(cell disruption),9,物理和化学两大类方法,22,1、物理破碎：研磨（手磨，球磨和石磨），机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等），高压法，爆破性减压法，专用波振荡，快速冷冻融化法等。,23,2、化学破碎：渗透作用 自溶：酶处理 表面活性剂,24,（I）渗透作用 将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris缓冲液中，离心，加入 MgCl2剧烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来。,25,（II）自溶 向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透性改变保持一定时间后可以使细胞自溶；,26,（III）酶处理 用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁，使胞内酶释放,27,（IV）表面活性剂 膜结合的晶酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。,28,“丙酮干粉”处理法也适用于微生物材料，一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在O 以下的低温条件下，加入510倍预先冷至约-20 的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁(膜)，另一方面由于丙酮是有机溶剂，这种处理也有利于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤产生干扰，同时这种处理还能使某些膜结合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。但是应注意的是丙酮可能引起某些酶变性失效，有些酶则根本不能采用此法。,丙酮干粉法(acetone powder),29,微生物，由于种类不同，来源不同，处理的方法与难易程度也有些差异。霉菌通常比较容易对付，通过机械剪切、研磨或者加细胞壁溶解酶就能解决。对于细菌，少量的材料可用超声波破碎器和溶菌酶等处理，大量材料可用丙酮干粉法，或用自溶法(autolysis)。,30,自溶,所谓自溶，就是将浓的菌体悬液在适宜的温度与pH条件下直接保温，或加甲苯、乙酸乙酯以及其他溶剂一起保温一定时间，让菌体自溶液化。此法有人认为不是好方法，理由是：第一溶液中成分十分复杂；第二有破坏目的酶的危险。在工业生产中，细菌材料还可以用细菌磨或挤榨器等处理。至于酵母细胞，由于其壁厚较难对付，过去多用自溶法。后来采用的办法有：细胞壁溶解酶处理法；稀盐溶液振荡法；冷热破壁法。,10,31,二、抽提,大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。,11,32,1pH,首先应考虑的是酶的酸碱稳定性，选择的pH不能超出酶的稳定范围。其次，从最佳的抽提效果而言，选择的pH最好远离目的酶的等电点。也就是说，酶如果是酸性蛋白质，则宜用碱性溶液抽提，反之，碱性蛋白质宜用酸性溶液。例如，从肌肉中抽提甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以稀碱溶液效果最好，产量较高；胰蛋白酶的抽提，通常选用O.125MolL的硫酸，这是因为除了考虑到酶的稳定性、溶解性外，这种抽提条件下溶入的杂质也较少。最后，考虑到有利于切断酶和细胞内其他成分间可能有的联系，通常以选用pH46为佳。,12,33,1、提取的主要方法,（1）盐溶液提取（2）酸溶液提取（3）碱溶液提取（4）有机溶剂提取,34,2、酶提取过程的注意事项,pH的选择 盐的选择 温度的选择 抽提液用量 其它,35,2、酶提取过程的注意事项 pH的选择 盐的选择 温度的选择 抽提液用量 其它,36,pH的选择首先考虑酶的稳定性；其次应 远离等电点；一般选择pH4-6 为宜。,37,盐的选择 大多数酶在低浓度的盐溶液 中有较大的溶解度，一般选 择等渗盐溶液，如的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的NaCl等。,38,温度的选择 一般控制在0-4 0C，如果酶 比较稳定可以例外。例胃蛋白酶就可在37条件下保温抽提。,39,抽提液用量常采用材料量的1-5倍,40,其它加入蛋白酶抑制剂、半胱 氨酸或细胞色素C等，来 稳定抽提系统。例如，为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)；为防止氧化等因素的影响可加入半胱氨酸、DTT(dithiothreitol)以及惰性蛋白和底物等。,41,三、酶溶液的絮凝、净化与脱色,42,絮凝由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排 斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的 水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困 难；因此要用絮凝剂进行处理。絮凝剂：多种类型 无机：如醋酸钙和磷酸钙等 有机：如聚丙烯酰胺等 天然高分子：如壳多糖等,43,过滤或离心净化通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将细胞碎片等固性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以及脂类等大分子物质去除。,44,脱色酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。,45,四、浓缩,抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低，所以在进行纯化前往往须先加以浓缩(concentration)，这样一方面可使每一步的回收率升高，同时，酶和蛋白质在浓溶液中的稳定性也往往较高。,16,46,常用的浓缩的方法有以下几种,蒸发法超过滤法胶过滤法反复冻融干燥（冻干燥法）其他,47,1蒸发,一般的减压蒸发浓缩除了效率低、费时外，有时还要加热，并且可能产生泡沫，易使蛋白质变性失效，因此，不能用于稳定性较差的酶。同时，蒸发过程还可能出现增色现象，影响产品的质量,48,过去实验室中也采用超蒸发浓缩法，即让暖空气流通过冷的酶溶液表面，或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使之加速蒸发，但此法效率不佳。工业生产上现在应用较多的是薄膜蒸发浓缩，即将待浓缩的酶溶液在高度真空条件下变成极薄的液膜，并使之与大面积热空气接触，让其中的水分瞬时蒸发而达到浓缩的目的。由于水分蒸发时能带走部分热量，所以，只要真空条件好，酶在浓缩过程中实际受到的热作用不强，因而可用于热敏性酶类的浓缩。薄膜蒸发浓缩器有三种形式：升膜、降膜和刮板。对于较粘稠的样品，后一种形式似乎更为适合，不过薄膜浓缩常会带来增色现象。,49,2超过滤(ultrafiltration),这是在加压情况下，将待浓缩液通过一层只容许水分子和小分子选择性透过的微孔超滤膜，而将酶等大分子被滞留，从而达到浓缩目的的一种技术。这种方法的优点是：没有热破坏；没有相变化；保持原来的离子强度和pH；如果膜选择适当，浓缩过程还可能同时进行粗分，成本也不高，故为人们所乐用。超过滤可用于小量样品，也可用于工业生产规模，现在已有各种超过滤装置可供选择。如下图所示,17,50,图 用超滤器浓缩蛋白酶,51,3胶过滤(gel-filtration),这是利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25或G-50等能吸水膨润，而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的一种浓缩.通常采用“静态”方式。应用这种方法时，可将干胶直接加入样品溶液，胶吸水膨润一定时间后，再借助过滤或离心等办法分出浓缩的酶溶液。胶过滤浓缩法的优点是：条件温和，操作简便，也没有pH与离子强度等的改变。,18,52,4反复冻融(freeze-thawing),此法的原理是溶液相对纯水，会发生融点升高、冰点降低的现象。实施时可采用两种方式进行：一是先将溶液冻成冰块，然后使之缓缓溶解，这样，几乎不含蛋白质和酶的冰块就将浮于液面，而酶等则融解并集中于下层溶液(至原体积的四分之一左右)；另一种则是先让酶溶液缓慢冻凝，尔后再移去形成的冰块。冻融浓缩的主要问题是，浓缩过程可能会发生离子强度与pH的变化，从而导致酶失效，其次是需要大功率的致冷设备。,19,53,5.干燥,将固体、半固体或浓缩液中水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过程。方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥,54,6其他,如聚乙二醇浓缩法等，它们一般只能用于小量样品，而且成本很高。,20,55,第三节 酶的纯化原理与方法,在抽提液中，除了目的酶以外，通常不可避免地杂有其他小分子和大分子物质。其中，小分子杂质在相继的纯化步骤中一般会自然地除去，因此比较容易解决；大分子物质包括核酸、粘多糖和其他蛋白质。核酸和粘多糖往往会干扰以后的纯化，特别是细菌等的抽提液中常含有大量核酸，最好预先除去。核酸可加硫酸链酶素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或MnCl2等使之沉淀移去，必要时也可使用核酸酶。粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解有时也可用酶。这些杂质移除后，余下来的就是杂蛋白。纯化的主要工作，同时也是比较困难的工作，就是要将酶从杂蛋白中分离出来。,21,56,酶与杂蛋白的分离,酶与杂蛋白的分离，可参照已有的方法，也可另外设计和建立新的工艺流程。但为了获得较理想的分离效果应注意以下问题：(1)工作前应对所要纯化的酶的理化性质如溶解度、分子大小、电学解离性质和酶的稳定性等有一个较全面的了解。这样，就可以知道应选择哪些方法与条件，而应避免哪些处理，以及在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。,22,57,(2)判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力测定为准则。一个好的步骤应该是比活力(纯度)提高大、总活力回收高，而且重现性好。一般地说，纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件，因为这样只能使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度进一步上升。(3)要严格控制操作条件，这样，一方面可保证高的重复率，另一方面又可防止酶的变性失效，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、溶液中的蛋白浓度逐渐下降，蛋白质间的相互保护作用随之减小,酶的稳定性也因之降低，这一点尤为重要。,58,现有纯化方法都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异以及酶的生物特性为依据而建立起来的，包括：,(1)根据溶解度的不同，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法及选择性沉淀法等。(2)根据分子大小的差别，有胶过滤(层析)法、超过滤法及超离心法等。(3)根据电学、解离性质，有吸附(层析)法、离子交换层析法、电泳法以及集层析与电泳之长的聚焦层析法等。(4)基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点而建立的各种亲和分离法等。(5)利用稳定性差异而建立的选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法。值得提到的是，在这些方法中往往同时有两种或多种因素在起作用。,23,59,一、根据溶解度不同进行的纯化,1、盐析(Salting Out)法2、降低介电常数法（有机溶剂沉淀 法）3、等电点沉淀法4、共沉淀法5、选择性沉淀法6、液液分离法,24,60,1盐析法,盐析法是古老的、但也是目前仍广泛采用的方法。盐析法根据的原理是：球蛋白类在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增大，表现“盐溶”(salting in)特性。但是当盐浓度继续升高，并超过某一上限时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别“盐析(salting out)”沉淀析出。,61,原因：,这是因为盐浓度较低时，盐离子与蛋白质分子中的极性和离子基团作用，降低蛋白质分子的活度系数使其溶解度增加。而在高浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度增加而减少，结果使酶蛋白沉淀而析出，则称为“盐析”。这是因为盐离子与水这种偶极分子作用，使水分子活度降低，导致蛋白质水合程度减少，从而趋使酶蛋白溶解度降低。由于在某一盐浓度下酶与其他杂蛋白溶解度不同，因而可达到彼此分离的目的。盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别而建立的一种纯化方法。,62,63,为了获得较好的盐析效果，应控制下述因素：,(1)pH 控制盐析pH可以提高纯化效果，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶在某一盐浓度下可通过改变pH而达到纯化。但一般来说，pH可选择的范围不大。大多数情况，盐析的pH宜接近待纯酶的等电点。有些情况，酶和杂蛋白能形成某种结合，从而干扰盐析分离。此时如控制pH5或PH 6，使它们带相同电荷可以减少络合物形成，这样盐析效果常会有些改善。,25,64,(2)盐,在纯化的最初阶段，盐性质的影响不一定很明显但是随着酶的纯度提高，盐的特征效应就可能突出出来。一般地说，盐析常数Kso越大，效果越好。,65,实践表明,就阳离子而言，一价盐通常比二价盐有效；而阴离子则相反，二价盐比一价盐好。符合这种条件的盐有硫酸铵、硫酸钠等。硫酸铵最常用，它的最大优点是：溶解度大，溶解的温度系数小(0，706gL;25，767gL)，即使是在低温的溶解度范围内，几乎所有蛋白质都能盐析出来。,66,用硫酸铵进行盐析时，溶液的盐浓度通常以饱和度表示，即以饱和溶液中盐的饱和度为100，即相当于4mol/L(0)进行计算。调整溶液的盐浓度有两种方式，当蛋白质溶液体积不太大，而要达到的盐浓度又不太高时，为防止加盐过程中产生局部浓度过高，最好添加饱和硫酸铵溶液，加入量可按下式计算：VVo(S2-S1)(1-S2)4.2 V和Vo分别为应加入的硫酸铵饱和溶液体积与蛋白溶液原有体积；S2和S1为要达到的和原有的硫酸铵饱和度。浓的硫酸铵溶液的pH通常是4.55.5，调节pH可用硫酸或氨水。,26,67,测定溶液的pH时，一般应先稀释l0倍左右，然后再用pH试纸或pH计测定。另一种情况是蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高，此时则以加固体硫酸铵为宜，加入量可通过计算，也可以直接查表。加固体较为经济，也较方便,但所用的固体应充分研细，并在不断搅拌下缓缓加入，以避免局部过浓，同时要防止泡沫大量生成。,68,(3)温度,从酶的稳定性和溶解度而言，盐析温度以控制在4为宜；,69,(4)蛋白质浓度,这是一个十分重要、而又常被忽视的因素：它一方面能影响盐析效果的重现性，因为蛋白浓度不同，分级分离范围也往往会发生一些变动；另一方面，蛋白浓度在100ugml以下，盐析沉淀一般很困难，有时甚至根本不能形成沉淀。在200ug/ml-1mg/ml范围内，沉淀虽能生成，但时间较长，而且回收率往往不高。为了获得较好的盐析效果，蛋白浓度应在1mg/ml以上。,27,70,(5)盐析操作,盐析沉淀通常至少要近一小时才能完成，沉淀可通过离心或压滤和母液分离。盐浓度低时，离心比较容易，而过滤较难；浓度较高时，需要高速离心，但过滤较易。盐析如果在碱性条件下进行，而盐浓度又很高(譬如大于50 S)时，盐析物常常不易离心沉降，有时还可能出现上浮现象。为使以后的纯化具有较好的重现性，盐析后沉淀中夹带的母液应尽量除尽。,71,获得盐析沉淀后，可将其溶于适当的缓冲液中，并除去不溶蛋白，这样相当于又一次纯化。有时也可用不同盐浓度的溶液对沉淀进行分级的溶解。,28,72,盐析法的优缺点,盐析法的优点是：简便、安全(大多数蛋白质在高浓度盐溶液中相当稳定)、重现性好。其缺点是：分辨率低，纯度提高不显著，同时还常常有脱盐问题。盐析法的一个发展就是和层析技术相结合形成盐析层析法(salting out chromatography),即以琼脂糖等非极性物质为柱层析的支持体，在高盐浓度条件下将样品中的蛋白质盐析吸附下来，然后再梯度地降低盐浓度，使酶和杂蛋白分别洗脱出来,这种技术的优点是纯化量大，重复性好，分辨率较高。,73,2有机溶剂沉淀法,此法的原理是，不同的蛋白质需要加入不同量的有机溶剂才能使它们分别从溶液中沉淀析出。有机溶剂在这个过程中的主要作用是降低溶液的介电常数，因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子间的引力增加，溶解度降低。有机溶剂的另一作用可能是部分地引起蛋白质脱水而沉淀。不过，蛋白质溶解度和有机溶剂浓度之间目前还没有一个可用的关系式。,29,74,进行有机溶剂沉淀处理时，应考虑以下因素:,影响介电常数的主要因素：温度 有机溶剂 离子强度 pH值：,30,75,(1)温度,这是最重要的因素，因为大多数蛋白质遇到有机溶剂很不稳定,特别是温度较高(例如室温)的情况下，极易变性失效，故操作应在0 以下进行。有机溶剂也必须预先冷却到-20-15，并在搅拌下缓慢加入。沉淀析出后应尽快地在低温下离心分离,获得的沉淀还应立即用冷的缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。个别酶对有机溶剂比较不敏感，比较稳定，此时可在较高温度(如室温)下进行操作，以便除去较多的杂蛋白。,76,(2)pH,由于蛋白质处于等电点时溶解度最低，故有机溶剂沉淀也多选在靠近目的酶的等电点pH条件下进行。例如，“肌肉酶”的分离在pH 6.5时效果较好。pH调整通常选用0.05molL的缓冲液。,77,(3)离子和离子强度,中性盐在多数情况下能增大蛋白质的溶解度，并能减少变性影响。在进行有机溶剂的分级沉淀时，如果适当地添加某些中性盐。例如，5-10的硫酸铵，往往有助于提高分离效果。但盐的浓度一般不宜超过0.05mol/L，否则沉淀不好，甚至沉淀全无，同时有机溶剂消耗也多。,78,多价阳离子效应,在进行有机溶剂沉淀时，也可利用多价阳离子效应，即在向酶溶液加入有机溶剂时，可将溶液的pH调整到略高于目的蛋白质的等电点，使之带有负电荷，然后再添加少量(0.0050.02mol/L)的多价阳离子，例如Zn2+、pb2+。等，由于这些离子能和阴离子蛋白质形成络合物，降低其溶解度，从而可减少有机溶剂的用量，同时也可提高分离的分辨效果。但是，应注意磷酸盐存在的情况下不能用Zn2+以免导致磷酸锌沉淀形成。,31,79,(4)有机溶剂,用于蛋白质纯化的有机溶剂中，丙酮的分离效果最好，引起失效的情况也较少。除丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。有机溶剂浓度通常以百分体积比表示，加入量可按下式计算：VVo(S2-S1)(S-S2)其中，V和Vo分别为应加入的有机溶剂体积和原溶液的体积，S、S1和S2分别为待加的有机溶剂、原来溶液中含有的有机溶剂和溶液所要达到的有机溶剂的百分浓度。有机溶剂沉淀法的优点是：分辨率高，溶剂容易除去。缺点是酶在有机溶剂中一般不稳定，易引起变性失效。,80,3共沉淀法,32,一些大分子非离子型聚合物如聚乙二醇（PEG）,聚乙烯亚胺（PEI）单宁酸，硫酸链霉素以及表面活性剂（SDS）等在一定条件下可以直接或间接与蛋白质形成络合物而沉淀析出,再用适当的方法使酶溶解出来。,81,4、选择性沉淀法,33,有些多聚电解质可以在极低浓度下选择性地与某些酶结合而形成沉淀。如聚丙烯酸（PAA）可以与某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下：PAA+酶 PAA-酶 PAA-酶+Ca 2+PAA-Ca 2+酶 PAA-Ca 2+SO4 2-CaSO4+PAA,82,5等电点沉淀法,等电点沉淀根据的原理是，蛋白质的溶解度随分子间引力增大而变小，当其他条件相同时，分子间的引力在蛋白质处于等电点状态最大，因而容易沉淀析出。由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，沉淀往往不完全，故而一般很少单独使用，更多的是用作其他沉淀法中一个组合条件。例如，用于除去杂蛋白，因为在某种pH条件下，样品中不仅会使处于等电点状态的蛋白质沉淀，对于等电点两侧、带相反电荷的杂质也可能因形成复合物而沉淀。,34,83,从而可除去大量杂蛋白。纯化动物材料抽提液中的酶时，就可先将pH调整至5左右，待放置片刻后，核蛋白等颗粒杂质就会沉淀析出，使酶溶液达到“一步澄清”。又例如，纯化血清胆碱酯酶时，可先将pH调至2.83.0，除去酸性杂蛋白。值得顺便提到，调整溶液的pH时，应选用具有相同离子的酸、碱或缓冲液。,84,6液液分离法,如果说，上面介绍的方法是利用溶解度差别进行的，那么，从广义上说，它们都是以分配系数的不同为基础的纯化方法，属于“固液”类型；与此相对应的，近年来也开发了“液液”类型的分离法，这种方法又称为双相(水溶液)分离法(aqueous two-phase separation)。它实际上就是利用酶和杂蛋白在不相混溶(的多聚体形成)的两相系统中分配系数不同而达到纯化目的的方法。以聚乙二醇(PEG)和右旋糖酐(dextran)形成的两相系统为例，在这样的双相系统中，上相主要是PEC，下相主要的是dextran，分配系数义定义为：,35,85,其中，M为待纯化物质的分子量，A为系统的特性系数，kB为Boltzmann常数，T为绝对温度。通过选择和控制两相系统中多聚物的种类与浓度、系统的pH、离子和离子强度以及温度，就有可能使酶和杂蛋白达到很好的分离。这种方法的优点是：条件温和，适于大量样品的纯化；但成本高，纯化后还须除去介质带来的多聚物。,其中C上和C下分别为酶或蛋白质在上相和下相中的浓度。酶和蛋白质的K通常介于0.1与0之间。由于这种分配服从Brnstedt方程：,86,二、按照分子大小进行的纯化,36,透析胶过滤(层析)法筛膜分离法超离心分离法。,87,1、透 析(Dialysis)法：过程：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留在透析袋中；透析袋类型：有两种，再生纤维素膜透析袋和纤维素酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截留值（1102D）；商品名为spectrapor等。透析袋的预处理：干燥的透析袋在制备过程中曾用10%甘油处理过，只要浸泡湿润和蒸馏水洗涤即可使用；必要时可用10mmol/L 碳酸氢钠，50%乙醇和10mmol/L EDTA处理后，再用蒸馏水洗涤。,88,透析袋,酶溶液,蒸馏水,89,透析装置和过程,90,2胶过滤(层析)法,胶过滤(层析)法(gel filtration or gel permeation chromatography)是Poratch和Flodin最早建立的，现在已广泛用于生物大分子的纯化。原理：又称分子筛层析，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。,91,这种方法的原理如图所示。它通常以柱层析的方式进行。柱中填充分子筛介质，常用于生物大分子分离的分子筛介质是具有一定孔径的球状凝放物质。层析柱中装入(选择好的)适当孔径的凝胶物质以后，加入待纯化样品，再用适当的溶剂或缓冲液使样品在柱中自上而下地扩展。这样，样品中的各种分子将技其分子大小表现不同的层析性态而分离。,92,大于凝胶孔径的分子由于不能进入胶粒内部，只能沿胶粒间隙扩展，因而走的是一条较“直”的“路”，表现出较快的移动速度；反之，小于凝胶孔径的分子，由于它们能自由进出胶粒内外，按照分子热运动的规律，其运动轨迹“迂回曲折”，因此，表现为较慢的下移速度。所以，待纯化样品通过一定长度的层析柱后，不同大小的分子都将按先后顺序依次流出，彼此分开，达到纯化目的。由于某些分子被排阻在胶粒外，故这种层析又称为胶排阻层析(gel exclusion chromatography)。,93,凝胶过滤,94,凝胶过滤,95,Tubes march in from left,A280,Fraction#,96,部分使用的担体,目前使用最广泛的担体材料：交联后的葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺 琼脂 其它物料,97,98,为了使胶过滤有较好的分离效果，应考虑以下问题：,(1)胶的选择 作为分子筛的凝胶是由亲水的线状聚合物通过交联剂交联，或通过聚合物自身缔合组成的、具有网眼结构的胶粒物质。网眼孔径大小由交联程度和聚合物的浓度决定。最常用的凝胶有如下几类：,38,99,葡聚糖凝胶，是相对分子质量从几万到几十万的葡聚糖通过环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质，可用于相对分子质量1000-500000分子的分离。以商品Sephadex G-为例，G-后的数字为胶膨润时吸水量的10倍，如G-25就表示该胶物质每1g能吸水2.5ml，这个数字越大，说明吸水量越高，孔径也越大，更适合于较大分子的分离。表4.2是各种Sephadex的特性数据。另一类商品为Sephadexe LH-，它和G-类型不同，是兼具亲脂性和亲水性的凝胶，可用于脂类化合物的分离。此外还有一种类型称为Sephacyl S-，它是通过N，N-甲叉双丙烯酰胺交联形成的烯丙基葡聚糖，可用于水溶液系统，也适合于有机溶剂或高浓度氢键解离试剂存在的系统。,100,各种Sephadex葡聚糖分子筛凝胶,39,101,聚丙烯酰胺凝胶，是丙烯酰胺与交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺共聚得到的交联凝胶物质。以商品Bio-Gel P-为例，P-后的数字乘1000,表示该胶可用于分离的最高相对 分子质量(亦即排阻的相对分子质量)。聚丙烯酰胶凝胶适合于分离的范围和葡聚糖凝胶大致相同。表4.3是各种Bio-Gel P-的特性数据。,40,102,各种Bio-Gel聚丙烯酰胺分子筛凝胶,41,103,琼脂糖凝胶,是琼脂抽去琼脂胶等后得到的D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖相间排列组成的链状多糖。和上述两种凝胶不同，琼脂糖凝胶不包含另外的交联物质，是通过琼脂糖本身缔合而成的网眼结构物质，孔径大小由胶的浓度决定。以商品Sepharose为例，2B、4B和6B等分别表示琼脂糖含量为2、4和6。这类凝胶的孔径都比较大，适于相对分子质量较大的物质如病毒、细胞颗粒体和DNA等的分离。表44列举了Sepharose的有关特性数据。琼脂糖凝胶还有另外两种商品，一为Bio-Gel A-,它是琼脂糖与丙烯酰胺的交联胶，可用于有氢键分解试剂存在的情况，而且有较致密的孔径，适用于蛋白质的分离。另一为Sepharose CL，它是在强碱性条件下和3，3-二溴丙醇反应的产物，适用于有机溶剂和氢键分解试剂存在的情。,43,104,某些Sepharose琼脂糖分子筛凝胶,43,105,上述各类凝胶都有很高的亲水性，能在水中膨润。膨润后的凝胶具有一定的弹性和硬度，并有很高的化学稳定性，在盐和碱溶液中都很稳。可应用于4-9的pH范围；但是，如果在pH 2以下的酸性条件下长时间处理，则有水解破坏的可能。此外，它们对氧化剂也较敏感。上述胶都没有易于解离的基团，因此很少非专一性吸附。Sephacryl，Sepharose CL和Bio-Gel A相对Sephadex与Separose而言,在化学稳定性与机械强度上都有所增强，因而适用面更广。,44,106,胶过滤(层析)法在酶的纯化工作中有三种类型的应用：,浓缩 族分(包括脱盐、更换缓冲系统以及分离底物和产物分离等)分级分离。前两种应用通常选择小孔径胶如Sephdex G-25，因为它们有较好的机械强度和流动特性,并足以对付相对分子质量在5000以下的分子。至于分级分离，则须根据待纯化样品来选用胶，不过，如果使用低排阻极限的胶Sephadex G-75，那么，所需要获得的组分可较早地流出，而且有助于提高回收率和减少稀释，同时这类胶的硬度也较好，可得到较大的流速。,107,至于胶粒大小，不同凝胶有各自的规格。以Sephadex G-为例，它有四种等级：超细、细、中粗和粗。随着胶粒变细。分离效果(即分辨率)也升高；但是若按层析的流速，粗粒级为好。通常实验室工作中:族分:可用中粗或粗级胶粒;常规的分级分离:则一般用细级胶粒 分析性的工作：超细级胶粒多用于。,108,(2)柱层析的基本过程与要求,柱层析是十分常用的纯化方式 柱层析一般包括如下环节：层析介质的平衡、装柱、加样、扩展(包括洗涤和洗脱)以及与此同时进行的流出液成分(蛋白质或酶活性)的检测和分部收集。柱层析的结果通常以洗脱曲线的形式表示，即以流出液中的蛋白质浓度(如A280)或酶活力相对洗脱(液)体积(Ve)的图形(图42)表示。,45,109,柱层析洗脱曲线(A)洗脱体积(Ve)的确定方法(B),46,110,(4)其他有关问题,样品：胶过滤(层析)法与样品浓度没有太大的关系，即使是在蛋白浓度达到75mg/ml的情况下也无明显影响。但样品中如含有粘性成分，则分离效果可能改变。扩展洗脱液：洗脱液组成一般不直接影响胶过滤的分辨率。通常，不带电荷的物质可用蒸馏水洗脱；荷电溶质可用Tris-HCl、磷酸盐之类的缓冲液，离子强度应控制在0.02mol/L左右，pH由酶的稳定性及溶解度决定。如果层析产品接下来要进行冰冻干燥，则可采用挥发性的缓冲液，如醋酸铵、重碳酸铵和乙二胺醋酸盐等。,47,111,胶的再生与保存：胶过滤在每个分离过程结束后，由于胶本身没有什么变化，一般不需要特殊的再生处理，经过蒸馏水、稀盐或缓冲液洗涤后又可继续使用；如有尘粒污染可用反向上行法漂洗；如有微量的非专一性的交换或吸附，则可先用0.1N HCl或O.1N NaOH处理，然后再用蒸馏水洗至中性。为防止微生物污染，可用0.02%NaN3流洗，但应注意到NaN3；可能对某些酶有抑制作用。洗净的胶，通常可以膨润状态置于冷室中长时间保存。,112,几种常用脱盐方法的比较,胶过滤有三类应用：浓缩已于前一节讨论；族分，主要是脱盐，脱盐也是酶的分离纯化工作常需解决的问题，表4.6列举和对比了几种脱盐方法，从中可以看出，胶过滤法在各个方面都略胜一筹，但是，胶过滤法主要的应用还是分级分离纯化。胶过滤法特点是：不受pH、盐和温度等的影响，操作条件温和、简便，而且勿需特殊的再生处理，适于各种分子的分离。,48,113,3筛膜分离法,筛膜分离法，即超过滤分离法(ultrafiltration)，这是利用微孔超滤膜仅能选择性地透过一定大小的分子而达到分离目的的一类方法。此法操作简单，条件也温和，但是只能达到粗分的要求。,49,114,4超离心分离法(ultracentrifusion),这是利用样品中大小不同的分子在相对离心力场达80000250000 g条件下分布不同而进行的一种分离纯化方法。但是，此法主要用于病毒、细胞颗粒体等的制备，对于分子量较小的酶或蛋白质分离效果一般不佳，分辨率不高而且费时。,115,（1）离心机的种类和用途（2）沉降系数 S（3）离心方法的选择 差速离心 密度梯度离心 等密度离心（4）离心条件的确定 离心力 离心时间 离心温度和pH值,116,梯度离心,密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大,向上逐渐减小蔗糖便宜，纯度高，浓溶液（60，w/w）密度可达1.28g/cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1-氯-2,3-环氧丙烷合成的高聚物，Mr 约400000。需要高密度和低渗透压的梯度时，可用Ficoll代替蔗糖。,117,118,三.建立在电学解离性质进行的纯化,1、吸附法（1）物理吸附法（2）羟基磷灰石法（3）离子交换吸附法-离子交换色谱法2、电泳法（1）区带电泳（2）等点聚焦电泳（3）粉末电泳3聚焦层析4.快速液相层析5.疏水层析,50,119,1吸附交换(层析)(adsorption)分离法,这也是最常用的一类纯化方法。原理如图4.5所示，它是利用样品中待纯化分子和杂质分子与吸附剂间的吸附能力与解吸性质不同而建立的分离纯化方法。这类分离或以静态方式进行，或以层析方式进行。但不管采用什么方式，一般都包括三个基本环节：加样吸附、洗涤洗脱 实际上，其中每一个环节都包含着目的蛋白质(或酶)和杂蛋白的分离，因此是一种十分有效的纯化方法。,120,121,吸附交换分离法原理示意图,根据吸附机制的不同，吸附剂可分为三种类型：“传统”物理吸附剂羟基磷灰石吸附剂离子交换吸附剂,51,122,(1)物理吸附(physical adsorption),传统的物理吸附剂常用的有白土、氧化铝和磷酸钙胶等。其中白土是具有强吸附力的一类粘土，以硅酸铝为主要成分，包括皂土、高岭土和活性白土等；氧化铝根据制备方法不同有多种成品，用得较多的是Cr胶；磷酸钙胶可从氧化钙和磷酸三钠直接制备。物理吸附的机制