酶学与酶工程第三章酶的生物合成学生.ppt

第三章 酶的生物合成,微生物发酵产酶的优点：1）微生物种类繁多；2)微生物生长周期短，繁育快；3)微生物易改造，可通过多种手段育种。,第一节 微生物发酵产酶,一、产酶微生物的种类用于酶的生产的细胞必须具备几个条件(1)酶的产量高(2)容易培养和管理(3)产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染(4)利于酶的分离纯化(5)安全可靠，无毒性,（一）细菌1)无芽孢杆菌大肠埃希氏菌属(Escherichia)：变形菌门(Proteobacteria)纲：-变形菌纲(-Proteobacteria)目：肠杆菌目(Enterobacteriales)科：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)属：埃希氏菌属(Escherichia),大肠埃希氏菌属(Escherichia)：大肠埃希菌可用来制备多种酶假单胞菌属(Pseudomonas)：革兰氏阴性，r-变形菌纲，-酪氨酸酶(用于合成L-多巴，治疗帕金森病)、葡萄糖异构酶、溶菌酶、青霉素G酰化酶和脂肪酶,(2)芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。,(3)球菌微球菌属(Micrococcus)：微球菌属拉丁学名(Micrococcus Cohn,1872)细胞球形，直径0.52.0m，成对、四联或成簇出现，但不成链。革兰氏阳性。罕见运动，不生芽孢。严格好氧。菌落常有黄或红的色调。链球菌属(Streptococcus)：链球菌(Streptococcus)是一类球形的革兰氏阳性细菌，属于厚壁菌门的一个属。,2放线菌（actinomycetes)放线菌是一群高GC含量的革兰氏阳性细菌。放线菌能产生各种胞外酶，如蛋白酶、葡萄糖异构酶、溶菌酶等，而且放线菌还是生产抗生素的主要微生物。,链霉菌,3酵母菌酵母菌(yeast)是类单细胞微生物，但不同于细菌，属于真核微生物。酿酒酵母球拟酵母假丝酵母,拟酵母,4.霉菌霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。黑曲霉：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。,米曲霉：半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉菌落生长快，10d直径达56cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150300m，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。,青霉：一般指青霉属。为分布很广的子囊菌纲中的一属，和曲霉属有亲缘关系，有二百几十种，代表种是灰绿青霉，从土壤或空气中很易分离。分枝成帚状的分生孢子从菌丝体伸向空中，各顶端的小梗产生链状的青绿褐色的分生孢子。已知在生理学方面类似曲霉属，同时有很多能产生毒枝菌素,木霉：木霉属于半知菌亚门，丛梗孢目，木霉属，常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉等。,根霉：接合菌亚门、接合菌纲、毛霉目、毛霉科真菌中的一个大属。菌丝无隔、多核、分枝状，有匍匐菌丝和假根，借此可在基物表面广泛蔓延，不产生定形菌落。,毛霉：毛霉又叫黑霉、长毛霉。接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属。以孢囊孢子和接合孢子繁殖。菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝。,1土壤中的产酶微生物2水体中的产酶微生物3空气中的产酶微生物4极端环境中的产酶微生物,二、产酶微生物的来源,三、产酶微生物的分离和筛选,菌种除了可以分离筛选得到，还可通过向菌保中心购买，中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）中国林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC）中国药用微生物菌种保藏中心（CPCC）中国医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）中国海洋微生物保藏中心（MCCC）,国外菌种保藏中心：ATCC(American Type Culture Collection）美国典型菌种保藏中心 NBRC(NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心 CBS(Centraalbureauvoor Schimmelcultures)荷兰微生物菌种保藏中心 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)韩国典型菌种保藏中心 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)德国微生物菌种保藏中心,微生物进行发酵生产成为当今酶生产的主要方法。根据细胞培养方式的不同，酶的发酵生产可以分为固体培养发酵、液体深层发酵、固定化细胞或固定化原生质体发酵等。固体培养发酵液体深层发酵固定化细胞,四、发酵工艺条件及其控制,保存细胞,细胞活化,细胞扩大培养,发酵,分离纯化,酶,固定化细胞,预培养,无菌空气,原生质体,固定化原生质体,培养基,微生物发酵产酶的工艺流程,1.细胞活化性能优良的产酶细胞选育出来以后，必须尽可能的保持其生长和产酶特性不变异，不死亡，不被杂菌污染等。保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力，这就叫做细胞活化。,2.培养基培养基是人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。培养基多种多样，千差万别，但培养基的组分一般包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等几个方面。,培养基的设计原则：适宜的营养物质营养物质的浓度与配比合适物理、化学条件合适经济节约精心设计，试验比较,1）培养基的组分碳源凡能提供细胞营养所需的碳元素(碳架)的营养源，称为碳源(carbon source)。细胞中碳元素含量相当高，一般占干物质的50左右，因此碳源是工业发酵中使用的主要原料之一。原料的供应和价格 最常用的碳原为淀粉水解物,氮源凡能提供细胞生长繁殖所需氮元素的营养源，称为氮源。氮源主要功能是构成细胞的蛋白质、核酸以及含氮代谢产物；同时，当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。氮源可分为有机氮源和无机氮源两种。有机氮源无机氮源培养基中碳和氮两者的比例对酶的产量有显著的影响。C/N,无机盐和微量元素无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少的无机元素，并对培养基的pH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。各种无机元素的功用各不相同，细胞的主要组分酶的激活剂或抑制剂对培养基的pH、渗透压、氧化还原电位起调节作用大量元素和微量元素,生长因子生长因子(growth factor)是一类对细胞正常代谢必不可少且不能用简单的碳源和氮源自行合成的有机物。它的需要量一般很少。广义的生长因子除了维生素外，还包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、以及动植物生长的激素等。,水：水是微生物最基本的成分（70%-90%）水是微生物吸收营养物质、排泄代谢物的溶剂水细胞成分，直接参与代谢活动调节细胞环境的温度稳定,2）发酵培养基制工业发酵培养基时的一般要求为：营养物质的组成较丰富在一定条件下，所采取的各种原材料彼此之间不能产生化学反应，理化性质相对稳定黏度适中，具有适当的渗透压原材料的品种和浓度与代谢产物生物合成中的调节关系生产过程中的问题质优价廉，成本低。,3.pH的影响及其控制(1)pH对发酵的影响pH对微生物代谢活性产生影响的主要原因有下列几方面：细胞内的H或OH-离子能够影响酶蛋白的解离度和电荷情况pH影响细胞对基质的利用速度和细胞的结构pH影响细胞膜的电荷状况,(2)影响pH变化的因素发酵过程中培养基pH的变化由菌种的特性，培养基组成，发酵条件等决定，引起pH变化的主要原因：生理酸性盐 生理碱性盐(3)发酵pH的确定和控制 1)发酵pH的确定 2)pH的控制首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方：其次可在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控制溶解氧调节，控制代谢中间产物的氧化程度,4温度对发酵的影响(1)发酵温度的影响温度的变化对发酵过程可产生两方面的影响：一方面是影响各种催化酶反应的速率和蛋白质的性质；另一方而是影响发酵液的物理性质,(2)影响发酵温度变化的因素在发酵过程中温度的变化主要是由于发酵过程中既存在产生热能的因素，又存在散失热能的因素。(3)最适温度的选择与控制温度控制一般采用热水升温、冷水降温的方法，故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，以保证能较好地控制发酵过程中的温度。,5溶氧的影响及其控制(1)溶氧的影响细胞的生长繁殖以及酶的生物合成过程需要大量的能量，这些能量一般是由ATP等高能化合物来提供。为了获得足够的能量，以满足细胞生长和发酵产酶的需要，培养基中的能源一般由碳源提供。碳源必须经过有氧分解才能合成大量的ATP。,(2)溶氧浓度的控制 发酵液的溶氧浓度变化，是由供氧和需氧两方面所决定的。控制发酵液中的溶氧浓度，需从如下两方面着手：1)从供氧方面考虑 提高氧分压。增加通气量。延长气液接触时间。增加气液比表面积。改变培养液的性质。添加氧载体。,2)从需氧方面考虑根据需氧，可采用以下两方面的手段来提高发酵液中的溶氧速率：限制培养液中的营养成分，减少细胞生长速率。降低培养温度：,五、提高酶产量的措施除了具有高产的菌种及合理的发酵工艺外，还可通过一些其它的措施如添加诱导物。控制阻遏物浓度、添加表面活性剂等提高酶的产量。1.添加诱导物2.控制阻遏物的浓度3.添加表面活性剂4.添加产酶促进剂,发酵动力学主要研究在发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因子对这些速度的影响。在酶的发酵生产过程中，研究细胞生长和发酵产酶动力学，对于了解酶生物合成模式、发酵条件的优化机制、提高酶产量，均有相当重要的意义。,第二节 酶发酵动力学,微生物的生长过程可以用细胞浓度的变化来表示。以细胞浓度的对数与细胞培养时间作图，可知，在分批培养中，细胞生长一般经历调整期，指数生长期，平衡期，衰亡期。,一、酶生物合成的模式比较酶产生与细胞生长的关系,可把酶生物合成模式分成4种类型:。,通过计算比较的的生产与细胞生长的关系，可以把酶生物合成的模式分为4种类型：同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型。1.同步合成型：酶合成与细胞合成生长同步,（1）酶的生物合成可以诱导，不受分解代谢物 阻遏和反应产物阻遏；（2）当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止；（3）酶所对应的mRNA很不稳定。,2.延续合成型 延续合成型是指酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞进入平衡期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。,3.中期合成型 中期合成型是指：酶的合成在细胞生长段时间以后才开始，而在进入细胞平衡期之后，酶的合成也终止。,4.滞后合成型 这种类型只有当细胞生长进入平衡期之后，酶才开始合成并大量积累。,（1）mRNA的稳定性；（2）培养基中阻遏物存在与否。,影响酶生物合成的模式的主要因素是：,（1）mRNA稳定性高，细胞停止生长后继续合成其所对应的酶；（2）mRNA稳定性差，酶的合成随着细胞停止生长而终止；（3）受某些物质阻遏，细胞生长一段时间或在平衡期后（解除阻遏），开始合成酶。（4）不受某些物质阻遏，酶的合成随着细胞生长而同步增长。,规律：,（1）选择最理想的酶合成模式延续合成型；（2）改造非理想模式 A、同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提 高相应的mRNA的稳定性；B、滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢 物阻遏，使酶合成提早开始；C、中期合成型：努力提高mRNA稳定性，解 除代谢物阻遏物。,选择与改造,二、细胞生长动力学,主要研究细胞生长速度及其受外界环境影响的规律。1950年,法国的Monod首先提出表述微生物生长的动力学方程,细胞生长速率与细胞浓度成正比。,Rx=dX/dt=X,只存在一种限制性基质时:,Monod方程是基本的细胞生长动力学方程;从不同情况出发对其进行修饰。,:比生长速率；S 限制性基质的浓度；Ks 莫诺德常数；m 最大比生长速率,连续全混流反应器发酵过程中,稳态时游离细胞连续发酵的生长动力学方程:,dx/dt=(-D)X D：稀释率,D=0,分批发酵;Du细胞浓度下降,S升高,u回升;Dum X趋于零;,Monod方程与米氏方程相似,参数um与Ks也可由双倒数作图法求出.,三、产酶动力学,宏观产酶动力学（非结构动力学）:从整个发酵系统着眼,研究群体细胞的产酶速率；微观产酶动力学（结构动力学）:从细胞内部着眼,研究细胞中酶合成速率。,1、分类,研究细胞产酶速率及各因素对其的影响。,2、宏观产酶动力学方程通式,dE/dt=(+)x,X细胞浓度；u细胞比生长速率；生长偶联的比产酶系数；非生长偶联的比产酶速率。,细胞产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学关系也不同。,讨论:,（1）同步合成型：生长偶联型=0，dE/dt=X（2）中期合成型：特殊生长偶联型=0，dE/dt=X 有阻遏存在时，=0，无酶产生 dE/dt=0 阻遏解除后才开始合成酶.,（3）滞后合成型：非生长偶联型，=0,dE/dt=X（4）延续合成型：部分生长偶联型，0，0 dE/dt=X+X,dE/dt=(+)x,有关模型参数一般通过线性化处理及尝试误差法求出.,利用动植物细胞培养生产各种天然物质，是生物工程的一个新领域，20世纪80年代以来，利用植物细胞培养生产的有用产物已达100多种，其中酶制剂有10多种。包括糖苷酶(胡萝卜细胞，1981)，过氧化物酶(甜菜细胞，1983；大豆细胞，1989)等。呈现出良好的发展前景。,第三节 动、植物细胞产酶,一、动植物细胞的特点:,1、体积比微生物大；2、对剪切力敏感；3、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵周期长；4、动物细胞营养要求复杂；5、发酵产物不同,二、植物细胞培养和发酵,1、植物细胞发酵技术和特点：植物细胞发酵技术发酵特点（与直接提取分离相比较而言）：（1）提高产率；（2）缩短周期;（3）易于管理、减轻劳动强度；（4）提高质量。,2、植物细胞发酵技术(I)高产细胞系的选择：主要有以下几个途径：材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择,细胞工程和基因工程选择；(II)影响产物产量的因素：材料来源,培养基成分，光照和温度，pH，细胞形态分化程度等;(III)提高产物产量的途径：选择高产细胞系，控制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体，两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。(IV)植物细胞培养系统专用的生物反应器。,2、植物细胞发酵产酶的工艺条件控制（1）植物细胞生长和发酵所使用的培养基：大量无机盐、维生素和植物激素、无机氮源、碳源（蔗糖）MS培养基和B5培养基（2）温度和pH值（3）通风与搅拌（4）光照的控制（5）前体的添加（6）刺激剂的应用,三、动物细胞发酵,1、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶酶原活性剂等。2、动物细胞培养方法：悬浮培养；固定化细胞培养3、动物细胞发酵工艺条件的控制,第四节 固定化细胞发酵产酶,又称固定化活细胞、固定化增殖细胞用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。是70年代后期(1978)发展起来的技术;在发酵生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面取得了成功。,固定化细胞：,一、固定化细胞发酵产酶的特点,1、提高产酶率：细胞密度增大 生化反应加速 产酶率提高,固定化细胞发酵产酶的特点,2、可在高稀释度下连续发酵：D不影响固定化细胞;3、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；4、发酵稳定性好：细胞受载体保护，pH和T适应性宽；5、缩短发酵周期，提高设备利用率；6、产品容易分离纯化；7、适于胞外酶等胞外产物的生产。,二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制,与游离细胞发酵大同小异，需特别注意的几个问题：1、固定化细胞的预培养 先预培养，使固定在载体上的细胞生长繁殖，长好后，再用于发酵产酶，其培养基和工艺条件可以相同或不同。2、溶解氧的供给 由于受到载体的影响，使氧的供给成为主要的限制性因素。解决办法：（1）加大通气量（强烈搅拌会破坏固定化细胞）；（2）改变固定化载体，如少用琼脂等对氧扩散不利的载体；（3）过氧化氢酶与细胞共固定化，培养基加入适量的H2O2；（4）降低培养基的浓度，以降低培养基的粘度。,3、温度的控制 连续发酵时，由于D较高，反应器内温度变化较大，先预调流加液温度。4、培养基成份的控制 某些固定化载体的结构会受到某些成份的影响，如过量的磷酸盐会破坏海澡酸钙凝胶制备的固定化细胞。,第五节 固定化微生物原生质体发酵产酶,原生质体是除去细胞壁后由细胞膜及胞内物质组成的微球体。由于原生质体不稳定，通过凝胶包埋法可使之稳定性提高；可使原来胞内产物分泌到细胞外。,一、固定化原生质体的特点,1、变胞内产物为胞外产物；2、提高产酶率；3、稳定性较好；4、易于分离纯化。,二、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制,（1）渗透压的控制；（2）防止细胞壁的再生；（3）保证原生质体的浓度。,