酶分子工程化学修饰.ppt

第七章 酶的分子工程,之二：酶蛋白的化学修饰,酶修饰的方向,1 核酸水平2 蛋白质水平,本章主要介绍第二个部分,一、酶蛋白的化学修饰,酶的化学修饰主要是利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经一定的活化步骤后与酶分子上的某种氨基酸残基产生化学反应，从而改造酶分子的结构与功能。,二、酶的分子修饰的目的：,1.研究酶的结构与功能2.增强酶天然构象的稳定性与耐热性3.维持酶结构功能的完整性与抗蛋白水解酶4.消除酶的抗原性及稳定酶的微环境,SOD：,对普通非活性部位赖氨酸中氨基的修饰在保留原有的生物活性，稳定性增强、在体内半衰期长，由6min-15min,延长到15hr以上。SOD的化学修饰可以增强SOD构象的稳定性、抗蛋白水解酶的能力及消除对人体的免疫原性。真正能够产生抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗炎、祛班美容等功效。,具体说来，如：提高酶活力改进酶的稳定性允许酶在一个变化的环境中起作用改变最适pH值或最适温度改变酶的特异性；使它能催化不同的底物，使之转化为产物改变催化反应的类型提高催化过程的反应效率 等等,三、影响蛋白质化学修饰反应进程的因素,（一）影响蛋白质功能基反应性的因素微区的极性氢键效应静电效应位阻效应蛋白质功能基的超反应性,微区的极性,微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。介质极性降低，pK升高：乙酸：水 80%乙醇 100%乙醇 pK：4.76 6.87 10.32,从整体来看，局部极性的改变对色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反应性的影响最小；对氨基和组氨酸反应性的影响较大；对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性影响最大。极性对整个反应速度的影响还与反应的类型有密切关系,静电效应:,不同蛋白质中的组氨酸残基的pK值是不同的。例如，碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基，其pk值是：碳酸酐酶：5.91；6.04；7.00；7.23 葡萄球菌核酸酶：5.37；5.71;5.74；6.50组氨酸残基在这两个蛋白质中的pK值范围是5.377.23，几乎相差2个pH单位。模型化合物的数据指出，这些变化可能是由于带电基团相互影响所致。,位阻效应：,处于蛋白质表面的功能基，：一般说来比较容易与修饰剂反应。但是，如果烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这时就要出现位阻效应。对枯草杆菌蛋白酶：它的所有的10个酪氨酸残基均在蛋白质分子表面，而且其羟基几乎在所有情况下都没有形成氢键。但是，如果对它进行彻底硝化和碘化后，10个酪氨酸中，只有8个被修饰。这种情况很可能是空间障碍引起的。,蛋白质功能基的超反应性,超反应性：蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。多数蛋白质的功能基与简单氨基酸中的同样基团相比，反应性要差。但是，每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定的试剂显示出超反应性。酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应性的，但酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团，可能与酶的功能或构象没有明显联系。例如，木瓜蛋白酶中的19个酪氨酸残基中，只有一个能与二异丙基氟磷酸酯反应，修饰后酶活性并不改变。,还有几种因素也能改变蛋白质功能基的反应性，如电荷转移，共价键形成，金属螯合旋转自由度等。,（二）修饰剂反应性的决定因素,选择吸附静电相互作用位阻因素催化因素局部环境的极性,选择吸附,化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点，选择性地吸附在低或高极性区的，有时可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质-修饰剂复合物的形成。正象酶-底物复合物那样，蛋白质-修饰剂复合物形成后，修饰过程的速度加强了。这种速度加强，部分是由于选择性吸附的结果。,静电相互作用,带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位。静电相互作用可使修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向双功能基的一侧定位。此外，静电排斥力能抑制修饰作用,位阻因素,蛋白质表面的位阻因素，或者底物、辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。如果修饰剂的大小超过这个部位的大小，则不能发生修饰反应,催化因素,修饰部位附近的其它功能基，如果起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有明显差异。例如、对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐对胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸的乙酰化属于同一机理，但苯乙酸盐的反应性差，这在较大程度上与酶的酸碱催化有关。,局部环境的极性,许多有机反应的速度与溶剂的极性有关，而有些反应则与极性无关。溶剂效应是很复杂的,四、设计酶的化学修饰,（一）对酶性质的了解酶的活性中心酶的稳定条件最佳反应条件酶的侧链基团的性质等等,（二）修饰剂的选择,实际要根据修饰目的来选择：1）：如：对氨基的修饰可有几种情况：修饰所有氨基，而不修饰其它基团；仅修饰-氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基以及修饰具有催化活性的氨基等。修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件来控制。,1.选择修饰剂要考虑的问题,2）：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入最大电荷量的试剂。用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性pH下带正电荷的氨基转变成在中性pH下带负电的衍生物。,3）：如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，必须在水介质中进行反应，则试剂应选择在水中有一定溶解性的。,4）.在选择试剂时，还必须考虑反应生成物容易进行定量测定。如果引入的基团有特殊的光吸收用同位素标记。,5）.试剂体积过大，往往由于空间障碍而不能与作用的基团接近。一般来说，试剂的体积小一些为宜，这样既能保证修饰反应顺利进行，又可减少因空间障碍而破坏蛋白质分子严密结构的危险。,选择修饰剂是个综合权衡的过程：,修饰反应要完成到什么程度；对个别氨基酸残基是否专一；在反应条件下，修饰反应有没有限度；修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变；是否需要分离修饰后的衍生物；反应是否需要可逆；是否适合于建立快速、方便的分析方法等等,就修饰剂本身而言：,修饰剂自身的性质：修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白的吸附性修饰剂反应基团的数目和位置修饰剂上反应基团的活化方法与条件一般而言：要求修饰剂有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性、修饰剂分子表面有较多的反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长,2.用于修饰酶活性中心的氨基酸残基的试剂应具备以下些特征：,选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性的条件下进行；标记的残基在肽中稳定，很易通过降解分离出来，进行鉴定；反应的程度能用简单的技术测定。当然，不是单独一种试剂就能满足所有这些条件。一种试剂可能在某一方面比其它试剂优越，而在另方面则较差。因此，必须根据实验目的和特定的样品来决定使用什么样的试剂。,(三）反应条件的选择,除允许修饰能顺利进行外，还必须满足如下要求：一是不造成蛋白质的不可逆变性。（必须做对照试验）二是有利于专一性修饰蛋白质。为此，反应条件应尽可能在保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行。要考虑反应的温度、pH、反应介质和缓冲液组成缓冲液可改变蛋白质的构象或封闭反应部位，因而影响修饰反应，如，磷酸盐是某些酶的竞争性抑制剂，碳酸酐酶的酯酶活力能被氯离子抑制,反应基本条件,1.反应体系中酶与修饰剂的分子比例2.反应体系的溶剂性质、盐浓度和pH条件3.反应温度和时间以上条件随修饰类型不同有很大差异，需做大量实验验证确定,（四）反应的专一性,在蛋白质化学修饰研究中，反应的专一性非常重要。若修饰剂专一性较差，除控制反应条件外，还可利用其它途径来实现修饰的专一性。,1利用蛋白质分子中某些基团的特殊性,活性蛋白质特殊的空间结构能影响某些基团的活性。同样条件下，二异丙基氟磷酸酯（DFP）能与胰凝乳蛋白酶的Ser作用，迅速使酶失活不能与胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合物作用。在蛋白质分子中特别活泼的基团，在适当条件下只是其本身发生作用，而其它基团皆不作用，这种现象称为“位置专一性”，这是由于它在蛋白质分子中所处的位置环境所决定的,2选择不同的反应pH,蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)是不同的。所以控制不同的反应pH，也就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一性,如：用溴(碘)代乙酸(或它的酰胺)对蛋白质进行修饰时，试剂在不同pH条件下可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及-氨基、-氨基发生作用。pH ICH2COO-+蛋白质-SH 蛋白质-S-CH2COO-+H+I-pH 2 ICH2COO-+蛋白质-SCH3 蛋白质-S(CH3)CH2COO-+I-pH8.5ICH2COO-+蛋白质-NH2 蛋白质-NH-CH2COO-+H+I-pH5.5ICH2COO-+蛋白质咪唑基-NH 蛋白质-咪唑基-N-CH2COO-,3利用某些产物的不稳定性,在高pH下：氰酸、二硫化碳、O-甲基异脲和亚氨酸等氨基 脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用，但因pH高，与巯基形成的产物迅速被分解,4亲和标记,亲和标记是实现专一性修饰的重要途径。亲和标记试剂除了能与蛋白质作用外，还要求试剂的结构和与蛋白质作用的底物或抑制剂相似。在作用前，试剂先以非共价形式结合到蛋白质的活性部位上，然后再发生化学作用，将试剂挂在活性部位基团上。例如，对甲基苯磺酰氯能作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上,又如：TPCK对胰凝乳蛋白酶活性中心组氨酸咪唑环的亲和标记,5差别标记,在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们保护着蛋白质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用。然后将底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质再与含同位素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制剂保护的基团是带放射性同位素标记的。用这一方法可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。,6利用蛋白质状态的差异,有时在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。例如，核糖核酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在119号His上，对第12号His的修饰很少，两者之比为60：1。但在水溶液中进行同样的修饰时，两者之比为15:1，换言之，在晶体状态下羧甲基化反应的专一性比溶液状态下提高3倍,目前采用的方法：对酶蛋白的非活性主链进行部分水解；利用小分子或大分子物质对酶的活性部位或非活性部位的侧链基团进行化学修饰；对酶辅因子的置换而力图改变酶的反应类型等等,五、酶分子的化学修饰,（一）酶的表面修饰1.化学固定化：一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到惰性载体上；由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。,2.酶的小分子修饰作用：主要是利用一些小分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的一些基团（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖基和甲基等。,几种重要的修饰反应,1酰化及其相关反应,2烷基化反应,3氧化和还原反应,4芳香环取代反应,附：特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,1巯基的化学修饰,常用：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺,2氨基的化学修饰,3羧基的化学修饰,4咪唑基的化学修饰,5胍基的化学修饰,3.酶的大分子修饰作用：可分为非共价修饰和共价修饰两大类：1）大分子非共价修饰：利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互作用，对酶进行有效的保护。例如：聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连，从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用，排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶的稳定性增加。,2）大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。例如：用聚乙二醇共价修饰SOD，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰期，从而提高了药效。,聚乙二醇（PEG）_常使用的水溶性大分子修饰剂,溶解度高既溶于水，又溶于大多数有机试剂通常无毒性，也无抗原性生物相容性好,4.分子内交联：增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性的有效方法之一，例如：胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后，可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。,5.分子间交联：利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在一起形成杂化酶。例如：用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型。,蛋白质类修饰,血浆蛋白质，其中人血清白蛋白应用较多,6.脂质体包埋：一些医药用酶，如 SOD、溶菌酶等，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；用脂质体包埋法纪可解决这些问题。制止提是天然脂类或类固醇组成的 微球体，酶分子包埋在其内部，可以通过与细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。,7.反相胶团微囊化：这是近年来发展起来的酶在有剂相中进行催化的技术，反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中时可自发地形成近似球状的反相胶团，反相胶团是表面活性剂的疏水尾部朝外而极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳一定量的水，酶溶解在其中避免变性。,加H2O,疏水尾部,亲水头部,加酶液,S,P,E,E,E,图：反相胶团的结构和酶的分布,（二）酶分子的内部修饰非催化活性基团的修饰：通过对非催化残基的修饰可以改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的亲和力；通常可被修饰的氨基酸残基既可以是亲核的，也可以是亲电子的，还可以是是可氧化残基。酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶法进行修饰，用蛋白酶对主链进行部分水解，可以改变酶的催化特性。,催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称为化学突变法。肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，使肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰，然后在适当条件下，重新进行折叠,（三）与辅因子相关的修饰1.对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰：如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将辅因子共价结合于酶分子上；引入新的具有更强反应的辅因子。,（四）金属酶的金属取代：酶分子中的金属离子可以被其他金属离子取代，可以改变酶的专一性、稳定性等。概念 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。常用二价金属离子。金属离子置换修饰法只适用于本来在结构中含有金属离子的酶,举例,将锌型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。,修饰效果评价,对修饰反应评价因素：有多少修饰剂已经结合到蛋白质上；哪些氨基酸被修饰剂修饰，修饰度是多少；修饰物中有多少种不同形式的修饰剂蛋白质偶合物，每种各有多少,酶的化学修饰对其活性的影响,修饰蛋白在医学上的应用,如:抗白血病药物天冬酞胺酶的游离氨基经过脱氨基作用，酰化反应或羰工亚胺反应进行修饰后，该酶在血浆中的稳定性得到很大的提高；人的-半乳糖苷酶A经交联反应修饰后，酶活性比自然酶稳定；酶与聚乙二醇、多糖、某些蛋白质结合后酶的性质亦可得到改善，淀粉酶与葡聚糖结合后，热稳定性显著增加，该自然酶的半寿期只有2.5分钟，结合酶则为63分钟。,六、修饰酶的化学性质,1.热稳定性：一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性。,天然酶和修饰酶的热稳定性比较,酶,修饰剂,修饰酶,天然酶,处理条件(/时间),残留酶活(%),酰苷脱氢酶,胰蛋白酶,过氧化氢酶,溶菌酶,尿激酶,糜蛋白酶,右旋糖苷,右旋糖苷,右旋糖苷,右旋糖苷,人血清白蛋白,肝 素,37/100min,100/30min,50/10min,100/30min,37/48h,37/24h,70,100,46,64,40,90,20,99,80,0,95,50,2.抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。,酶,L-Asn 酶,SOD酶,Gln-Aln 酶,尿酸酶,腺苷脱氢酶,Arg 酶,过氧化氢酶,胰蛋白酶,抗原性,修饰剂,-葡萄糖苷酶,核糖核酸酶酶,PEG,PEG,PEG,PEG,PEG,PEG,白蛋白,白蛋白,白蛋白,Poly-DL-Ala,消 除,消 除,消 除,消 除,消 除,消 除,消 除,降 低,降 低,消 除,修饰酶的抗原性变化,3.对各类失活因子的抵抗力:化学修饰酶与天然酶相比,对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高,天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较,酶,抗抑制剂,抗蛋白酶,修饰剂,抗失活剂,过氧化氢酶,核糖核酸酶,溶菌酶,胰蛋白酶,-葡萄糖苷酶,尿激酶,右旋糖苷,右旋糖苷,右旋糖苷,右旋糖苷,白蛋白,右旋糖苷,抗胰蛋白酶,抗蛋白酶,抗糜蛋白酶,抗胰蛋白酶,抗SDS,抗大豆抑制剂,抗胃蛋白酶,抗胎盘抑制剂,抗尿素,抗SDS,天然酶与修饰酶的半衰期比较,酶,羧肽酶,Arg 酶,Gln-Asn酶,尿酸酶,超氧化物岐化酶,过氧化氢酶,修饰剂,半衰期,天然酶,修饰酶,白蛋白,白蛋白,糖肽,右旋糖苷,右旋糖苷,PEG,3.5h,17h,1.4h,1h,4h,6min,6h,12h,8h,20h,4h,8h,4.修饰酶在体内的半衰期：多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长。,天然酶与修饰酶的最适pH,酶,修饰酶,天然酶,修饰剂,糜蛋白酶,猪肝尿酸酶,吲哚-3-链烷羟化酶,猪肝尿酸酶,产沅假丝酵母尿酸酶,白蛋白,PEG,PEG,聚丙烯酸,肝 素,10.5,7.4-8.5,5.0-5.5,9.0,8.8,3.5,8.2,8.2,8.0,9.0,5.最适pH:大多数酶经化学修饰后，最适pH发生了变化，这在应用上具有重要意义。,6.Km 的变化:有些酶经化学修饰后，Km变大，这可能是由于屏蔽效应引起的。,七、酶化学修饰的应用领域,在基础酶学研究上探测酶活性必需氨基酸的性质和数目酶蛋白一级结构的测定酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白部分区域的构象状态酶的作用机理与催化反应历程酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶的固定化技术酶纯度的分析与检测,在疾病治疗上克服酶在体内的不稳定性 消除或降低酶的抗原性有助于酶分子到达并集中于病灶细胞在工业上的应用酶稳定性提高，使生产成本降低反应条件的改善和酶寿命的延长导致生产工艺的技术革新和改进。,八、蛋白质化学修饰的局限性,（1）某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。因为同一种氨基酸残基在不同酶分子中所存在的状态不同，所以同一种修饰剂对不同酶的修饰行为也不同。（2）化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。但是，如果在实验中控制好温度，p等实验条件，选择适当的修饰剂，这个问题可以得到解决。,（3）酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，但是射线衍射结构分析结果表明其它氨基酸侧链在维持酶的空间构像方面也有重要作用，而且从种属差异的比较分析，它们在进化中是比较保守的。目前还不能用化学修饰的方法研究这些氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。（4）酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需“的，为什么是必需的，还得用射线和其它方法。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。,