蛋白质的分离和纯化.ppt

,蛋白质的分离和纯化,一、蛋白质的分离,2.根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,Q:下列蛋白质如何提取？酸性蛋白质；水溶性蛋白质；脂溶性蛋白质；,偏碱性溶液 透析液（中性缓冲液）有机溶剂,原理 1.根据细胞的结构特点，选择不同的破碎细胞的方法（如研磨法、超声波法、酶解法等），使各种蛋白质释放出来。,一、蛋白质的分离,1.抽提方法：（1）酸性蛋白质：（2）水溶性蛋白质：（3）脂溶性蛋白质：,偏碱性溶液 透析液（中性缓冲液）有机溶剂,二、常用的分离方法,1.离心沉降法2.薄膜透析法3.凝胶色谱法4.电泳法,1.离心沉降法,原理：通过控制离心速率，使得分子大小、密度不同的物质发生分层沉降，从而分离出不同种类蛋白质。,离心时相对分子质量大的物质先沉淀。,2.薄膜透析法,（1）原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将蛋白质与其他小分子化合物分离开。（2）方法：将待分离的蛋白质溶液装入用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液中便可进行透析。半透膜能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。,小分子杂质（无机盐、单糖、二糖及氨基酸等）从透析袋中出来，而蛋白质留在袋内。,3.蛋白质分离的方法：,（1）透析法,3.凝胶色谱法,(1)凝胶：,由多糖类化合物（如葡聚糖、琼脂糖）构成的多孔球体，内含许多贯穿的通道,(2)原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。,(3)作用：使样品中分子大小不同的蛋白质按顺序分离出来,下图中最早洗脱下来的是什么？为什么？,用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快,D,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个,B,4.电泳,(1)概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,方向：向着与其所带电荷相反的电极移动。,(2)泳动速度和方向：,速度：带电分子的迁移速度跟各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小,形状有关。,一般来说，带电颗粒所带净电荷越多，直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。,电泳分离时，电荷量相差越大的物质相距越远。,醋酸纤维薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳：测定蛋白质相对分子质量。SDS能使蛋白质完全变性，SDS所带电荷大大超过了蛋白质原有电荷。迁移率取决于分子大小。,(3)类型（载体）:,使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少 B 分子的大小C 肽链的多少 D 分子形状的差异,下列有关蛋白质提取和分离的说法，错误的是()A.透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相同的电极方向移动,D,三、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定,1.样品处理,（1）洗涤红细胞（低速短时离心，生理盐水）目的：去除杂蛋白。血样先低速短时离心分离红细胞，然后吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。低速离心：防止白细胞沉淀。缓慢搅拌：防止红细胞破裂释放出血红蛋白。柠檬酸钠：防止血液凝固。,（2）血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。甲苯：溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。蒸馏水作用：使红细胞吸水胀破,1、洗涤红细胞的目的是 A.去除血清 B.去除杂蛋白 C.除去血小板 D.除去水,B,2、选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（）A.血红蛋白是有色蛋白 B.红细胞无细胞核C.红细胞蛋白质含量高 D.红细胞DNA含量高,A,3、为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是()A.要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠 B.重复洗涤直到上清液呈红色为止C.将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌 D.取血回来后，马上进行高速长时间离心,A,（3）分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液中速长时离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第二层为脂溶性物质的沉淀层，第三层是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。,将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,分离血红蛋白溶液,有机溶剂（无色透明的甲苯层）,脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）,血红蛋白溶液（红色透明液体）,红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）,取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（PH=7）中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。【注】缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的影响而保持pH稳定。使用PH=7的磷酸缓冲液，有利于维持血红蛋白的正常特性。,2.粗分离-薄膜透析法,1、下列操作正确的是（）A.分离红细胞时采用低速长时间离心 B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D.透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h,D,2、在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是（）A 洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B 洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C 洗涤过程选用0.1%的生理盐水D 透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质,D,3.纯化-凝胶色谱法,去除相对分子量大的杂质蛋白,凝胶色谱柱的装填,凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,凝胶色谱柱的装填,50cm高,样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,1、在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因()A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果B、气泡阻碍蛋白质的运动C、气泡与蛋白质发生化学反应D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密,A,2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面,A,4.纯度鉴定-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；分离血红蛋白溶液。（2）粗分离：薄膜透析法除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,（以血红蛋白的分离纯化为例）,三、蛋白质提取分离的程序,1、下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离属于的叙述中，错误的是()A.可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪红细胞中提取到DNA和蛋白质B.用不同浓度的NaCl溶液反复溶解于析出DNA可去除部分杂质C.透析法分离蛋白质的依据是利用蛋白质不能通过半透膜的特性D.进一步分离与纯化血红蛋白可用凝胶色谱法、离心法、电泳法等,A,2、下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是()A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、过滤后，用分液漏斗分离D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12h,C,3、以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述正确的是()A.红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水，重复洗涤三次B.将血红蛋白溶液放在质量分数为O.9的NaCl溶液透析12小时C.凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在D.蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢,C,4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是()A.防止血红蛋白被O2氧化 B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能,D,5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，错误的是（）A.采集血样后要高速短时间离心获得血细胞B.洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。C.在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白D.释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来,A,6、下列有关“血红蛋白提取和分离”的相关叙述中，正确的是()A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面杂蛋白B.将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质C.血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂D.整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构,D,