蛋白质和多肽的氨基酸序列测定.ppt
第五课蛋白质和多肽的氨基酸序列测定,蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级结构的信息也有助于对其基因结构的研究。目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来；正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍采用，可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解，也可以从C端进行分析。第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色谱进行分离分析。本章将就蛋白质和多肽的N端、C端氨基酸序列分析的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。,第一节 N端分析原理,一、耦 联 蛋白质和多肽的自由氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。,二、裂 解 在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的氨基，又可与PITC进行耦联反应。,三、转 化 ATZ氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液(25)中可转化成稳定的PTH氨基酸。,四、PTH氨基酸的鉴定 可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广泛应用于PTH氨基酸的鉴定。通常选用C18反相柱进行分离。,第二节 N端蛋白质序列仪三、气相序列仪 自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为12mg。1978年Tarr等将一种四级铵盐聚合物“polybrene”引入了蛋白质、多肽的序列测定，它能和肽链中的极性基团作用(非共价键合)而将蛋白质和多肽有效地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子生物学对蛋白质微量分析的要求，20世纪80年代初，Hewick及Hunkpillar等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构，它用弹筒型玻璃反应室(内部体积约0.05m1)代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用polybrene固定样品，Edamn降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式输送，其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列仪具有以下明显优点：灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需50100pmol；试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的l10，降低了费用；缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。20世纪80年代末又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不同样品的分析需要。另外，由于载有活性基团的功能性PVDF膜的问世，蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上，直接在上述两种序列仪上进行固相序列分析。,在这两种序列仪中，Edman降解后的PTH氨基酸衍生物可及时直接从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行PTH氨基酸衍生物的定性及定量分析，这样不仅快速可靠，而且防止了样品的损失。这两台仪器统一用电脑控制，包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图4.2为标准PTH氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在20min内将各组分较好分离，需选择合适的色谱条件，表4.1列出了各种条件的改变导致个别组分位置的迁移及图谱的改善。,第三节 影响N端Edman反应裂解率的因素 在测序中往往可以发现，即使N端很均一的蛋白质(第一个循环出现单个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是由于Edman反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为9598。因此，经过50次循环后，PTH氨基酸分析谱中将出现较多杂峰，影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至N端第50个氨基酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。对于有些蛋白质由于含有较多的对Edman反应敏感的残基或肽键，裂解效率将更低。循环至Ser和Thr时产率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与Ser和Thr上的羟基反应，继而部分封闭Ser和Thr的N端氨基。另外，丝氨酸和苏氨酸的PTI-汀生物也会部分转化成其他产物，造成产率的降低。耦联试剂PITC本身也将发生下列副反应，形成一些“杂质”。测序完成后，电脑将每个循环的产率处理，得出起始产率(initial yield)和重复产率(repetitive yield)，其中通过起始产率可以估计蛋白质的真实含量，有时可以推测N端是否封闭(和氨基酸组成分析测得的含量相差甚远)，而重复产率则表明机器是否正常运转。另外，如果蛋白质或多肽中含有过多的Ser、Thr、Glu、Trp等氨基酸残基，也将降低这两个数值。,第六节 C端序列分析 虽然建立在Edman化学法上的自动化N端测序技术日趋成熟，但仍有不少问题需借助C端序列分析来解决。C端测序尤其适合于基因重组蛋白是否正确表达的鉴定和大规模生产时的质量控制、N端封闭蛋白的分析以及DNA探针的设计。由于选择性对C端羧基进行耦联修饰并从C端逐一将氨基酸残基切下较N端测序困难，在过去的近20年里，虽然为数不少的蛋白质化学家致力于C端测序研究，但目前仍不能和N端测序技术程度媲美。蛋白质化学工作者曾利用羧肽酶分析C端氨基酸残基，但是由于不同的羧肽酶对个别氨基酸残基有选择性，使用时仍有一定困难。最近，由于对化学法测定C端技术进行了一系列改进，已有了自动化C端序列仪问世。所以介绍一种自动化C端测序方法的原理及应用。,一、C端分析原理 基于与N端Edman降解类似的原理，C端分析采用化学试剂与蛋白质和多肽的羧基反应，反应后的C端衍生物被切割下来，通过HPLC系统进行分离分析。一个完整的C端序列分析包括以下几个步骤：(1)活化 蛋白质和多肽C端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，并进一步环化成嗯唑酮，而侧链上的羧基形成的混合酸酐难以成环。C端的嗯唑酮在硫氰四丁铵的作用下，转化为乙内酰硫脲(thiohydantoin，TH)。,(2)酰胺化保护侧链羧基 侧链羧基形成混合酸酐后，与硫氰哌啶进一步作用形成酰胺，以保护侧链。,(3)烷基化 由于C端环化形成的TH衍生物较为稳定而不易被切割，因此产率不高。用溴甲基萘选择性地烷基化修饰硫原子，形成Alkylated-TH(ATH)衍生物，裂解产率将大大提高。,(4)修饰Thr和Ser的羟基 蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序，因此需要修饰。在活化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完全，在N甲基咪唑(NMl)和乙酸酐的共同作用下，Thr和Ser上的羟基基本被乙酰化。,(5)裂解和衍生 C端的ATH衍生物在酸性条件下与NCS反应而被裂解生成ATH氨基酸，新的C端自动形成TH，而不必重新活化。因此，整个测序过程只需在开始时对C端进行一次性活化，并修饰Asp和Glu侧链羧基以及The和Ser的羟基。实际上，循环反应的只有烷基化和裂解两步，其全过程图解如下图。,二、C端蛋白质序列仪 近年来，已有商品化的C端序列仪问世。C端序列仪一般由N端序列仪改装而成，其基本结构与后者相似，两者的不同之处主要在于：反应所用的试剂不同，因此两者不可兼容，否则极易堵塞管道；在C端序列仪中，所有的化学反应均在弹筒型反应室中进行，切割下来的ATHAA仅在转化腔内干燥和溶解后即进入HPLC系统分离分析；而在N端测序仪中，ATZ AA需在转化腔中转化为PTH-AA。,四、影响C端测序反应产率的因素 C端测序副反应较多，最高初始产率仅为20，而对于Glu，Asp，Ser，Thr等氨基酸，其产率将更低。如C端富含上述几种氨基酸，测序将十分困难。另外，一旦遇到Pro，由于吡咯环的存在而不能与乙酸酐反应成环，整个测序过程将终止。到目前为止，C端测序可测110个残基，一次测序需要的量比N端测序要大得多，至少需1nmol。此外，因为不同的氨基酸反应产率不同，所以，对图谱的分析也比N端测序复杂，需要较多的经验。目前C端测序结果最好的一个样品是马肌红蛋白原，可测C端10个以上残基，通常将其作为标准样品来判断仪器的稳定性。另外，由于副反应的存在，有的氨基酸将生成不止一种ATH衍生物。如Arg的ATH衍生物可能被乙酰化或烷化；Tyr-ATH可被乙酰化；Cys被修饰后将形成丙烯酰胺化的Cys-ATH以及脱氢Ala-ATH；脱水Thr-ATH将产生两个非对映异构体。,五、结语和展望 目前，C端序列测序技术已初步成熟，并开始发挥作用。但其反应的效率与N端Edman降解测序法有一定的差距。因此，目前的主要问题是如何提高反应的产率，特别是如何改善T，S，D，E几种氨基酸的测定，以及如何解决P终止测序的问题。如果在上述几方面取得进展，将使C端可测残基数大大增加，并减少样品所需量。另外，近年来发现，很多活性多肽的C端是酰胺化的，如果能检测酰胺化的C端残基，将对活性多肽的研究有很大的帮助。C端测序技术仍处于研究和发展阶段，虽然该技术还不尽完善，但对于确认表达蛋白的C端是否正确，以及判断在表达、纯化过程中是否发生了不必要的加工大有帮助。,
