色谱柱的选择-博纳艾杰尔科技.ppt
液相色谱柱的选择,杨定忠博纳艾杰尔科技；dz_客 服：400-606-80992010年11月12月 广东,影响C18色谱柱性能的主要因素,色谱柱与色谱填料的特性1、柱填料 硅胶纯度 粒径 比表面积 孔径2、色谱柱的构型 色谱柱直径 色谱柱长度3、固定相 键合类型 残余硅羟基的影响 反相键合相的保留行为 键合硅胶的稳定性,物理因素,化学因素,柱填料对色谱柱性能的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I,2.3-二羟基萘,2.7-二羟基萘,TF=1.31,Brand W,AQ Column 5m,4.6mm150mm,Brand Z,C18 Column 5m,4.6mm150mm,Venusil MP C18 5m,4.6mm150mm,Brand H,C18 Column 5m,4.6mm150mm,Brand U,C18 Column 5m,4.6mm150mm,！,TF=1.42,TF=1.39,TF=1.69,TF=？,流动相：甲醇：水=65：35流速：1 mL/min温度：35检测波长：230 nm 进样量：20 L,硅胶纯度金属含量,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II,硅胶纯度金属含量,d,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径,硅胶粒径和类型对柱效的影响,d,硅胶粒径和类型对压力的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II,目前市场主要可供选择的填料粒径 1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 2.7m 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo)3.0m，3.5m 普通快速分析 5.0m 常规分析,颗粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱压升高.,柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积,每克填料的表面积，与粒度，孔径有关比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)根据需要选择合适的比表面积,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I,多孔材料的95%以上表面在孔内部 样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部 孔径至少是样品流体学直径的4倍 300孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸,样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II,小生物分子的保留值在小孔径填料通常更大,条件：C8色谱柱，4.6150mm，3.5um，A溶剂，0.1%TFA水溶液；B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈水中；20min梯度，1030%B；60C，1.5ml/min,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径,色谱柱尺寸 对色谱分离的影响：短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低 长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长 窄径柱(2.1mm)-检测器灵敏度高 宽径柱(3-21.2mm)-载样量高,固定相对色谱柱性能的影响,固定相对色谱柱性能的影响：键合类型,A 纵向交联：保留和选择不稳定B 横向交联：宽pH适用，Durashell，C 单体键合：重现性好，柱效高D 单体（空间保护）：低pH稳定（Venusil ASB）,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,残余硅羟基的影响普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。解决方法封尾双层表面修饰,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,封尾键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。缺点：不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应）在pH3时，TMS易流失，耐用性，稳定性不好,TMS,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,硅胶双层表面修饰后 新增加表面层硅羟基活性更低新硅羟基pH=5.2，普通硅羟基pH约为3.5更对称的峰型 硅胶表面更均匀硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖重现性更好 表面纯度更高硅胶金属杂质被覆盖极性化合物保留和分离更好,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰代表产品：Venusil MP C18，Venusil ASB C18，Venusil HILIC,0.01 ng/mL Pseudoephedrine,Agela Venusil ASB C18,2.150mm,5m,Brand A C182.150mm,5m,Phenomenex Luna C18,2.050mm,5m,固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为,同一厂家相同硅胶基质的反相柱：保留值随含碳量的增加而增加 比表面积越大，保留值越大 键合碳链越长，保留越大C18 C8C3C1，长链之间差别不大,固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为,不同厂家色谱柱的保留值，选择性与峰型色谱柱：4.6*150mm，流动相：乙腈0.05M磷酸钾缓冲液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，,拖尾峰,T0（尿嘧啶）,P:吡啶L:苯酚N:N,N-二甲基苯胺B:4-丁基苯甲酸J:甲苯,固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性,键合硅胶的稳定性 低pH值，键合相流失 高pH值，硅胶溶解影响色谱柱寿命，方法不重现,固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性,低pH值，键合相流失,固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性,空间位阻保护，延缓键合相流失,空间位阻键合代表产品：Venusil ASB C18Zorbax SB C18,固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性,高pH值，硅胶基质溶解,pH9时，色谱柱的稳定性,固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性,碳杂化，延硅胶缓高pH值水解,表面碳杂化Agela Durashell RP,表面碳杂化示意图,博纳艾杰尔为您提供全面的LC解决方案,2010版药典LC方法开发服务全面的色谱柱选择低pH条件色谱柱（pH=0.8）Venusil ASB C18高pH条件色谱柱（pH=1-12）Durashell C18亲水色谱柱Venusil MP C18经济性通用色谱柱Odyssil C18色谱柱,总结：如何选择色谱柱,了解目标化合物的性质了解色谱柱的性质粒径，孔径，比表面积，pH适用范围,有问题吗，谢谢大家！,联系我：杨定忠,
