高效液相色谱PPT课件.ppt
,High Performance Liquid Chromatography（HPLC）,高效液相色谱技术与应用,主要内容,酸性和碱性样品酸碱平衡与反相保留缓冲液的选择pKa与化合物结构的关系离子样品反相分离的优化选择性的控制离子对色谱保留机制初始实验控制保留值范围和选择性离子交换色谱离子交换色谱保留机制方法建立硅胶柱,酸性样品和碱性样品,为方便讨论，我们定义“离子溶质”为在通常pH范围内含有一个或一个以上酸性或碱性官能团的有机分子。在HPLC分离条件下，离子电荷随pH发生变化的化合物简单地称作酸或碱。在反相色谱（RPC）中，疏水化合物样品的保留值较大。当某种酸（HA）或碱（B）发生解离，其疏水性将会大大减弱。因此在RPC中的保留值k可能下降1020倍。,几乎所有与pH相关的保留值变化均发生于pKa值1.5单位的pH值范围内,缓冲液的选择,最好先调节缓冲剂的pH，再加入有机溶剂。选择具体缓冲剂时，应切记的几种因素：缓冲容量UV吸收度其它性质：溶解度、稳定性、与样品和/或色谱柱的相互作用、挥发性、对HPLC系统的腐蚀等,缓冲容量,缓冲容量由pH、缓冲剂pKa及其浓度决定与样品化合物的情况类似，缓冲剂发生解离的pH范围为pKa1.5。只有在此pH范围内缓冲剂才能有效地控制pH值。1050mM浓度的缓冲剂对RPC分离一般足够,pKa与化合物结构的关系,若不知样品组分的pKa值，可以通过样品的分子结构估计出。,较好的流动相pH,样品中最常见的酸或碱取代基-NH2、-N(CH3)2等、碱性杂环和羧酸（-COOH）基团。与pH有关的保留值变化最可能发生于pH36的范围内，不包括烷基胺化合物。无论已知还是未知样品，开始RPC方法建立时最好选用pH微小改变不影响分离的流动相（pH3）,哪种HPLC法对离子样品最合适,RPC具有简单、应用范围广和较好的柱性能等特点，通常是首先的分离模式。若分离不够理想，还可考虑在流动相中加入离子对试剂。在离子对试剂浓度由零变至最大值时，会有RPCIPC保留值的连续变化。所以起初的RPC实验有助于后面IPC分离条件的优化选择。对特殊分离目的，可以考虑从离子对或离子交换色谱开始。,优化离子样品的相分离,离子样品反相分离的方法建立与中性样品有些相似，主要差异为需用：经pH缓冲的流动相硅羟基效应最小的反相柱当首次开始HPLC方法建立时，并不知道合适的分离是否需要改变pH，所以初始实验的流动相pH3最好。下一步通过调节流动相强度（%B），以使样品具有合适的保留值范围0.5k20。离子样品不大可能被强保留，很可能获得较宽的k值范围。因此方法建立的最佳方案是初始运行用梯度洗脱。梯度选用宽范围（如5%100%B），必须注意避免高%B时析出缓冲盐调整峰间距，即尽量扩大样品的分离度或降价保留值范围，以便进行等度分离。最后改变柱条件以最好地兼顾分离度、运行时间和柱压,选择性的控制,改变pH是改变分离选择性的最有效方式pH值变化常常可导致离子化合物k值发生10倍或更大的变化。其它可有效改变峰间距的条件是%B、溶剂类型（甲醇、乙腈、THF）、温度、柱类型（C8、C18、苯基、氰基）与缓冲剂浓度。,离子对色谱,离子对和反相HPLC共享有多种特征两种分离使用的色谱柱和流动相大致相似，主要区别是离子对色谱（IPC）的流动相中加入了离子对试剂。逻辑上，IPC是需进一步改善的RPC分离的一种补充方法,保留的基础,离子对试剂的浓度通过改变被固定相吸收的离子对试剂的多少，有可能将保留过程由反相连续地改变为离子交换色谱,当色谱柱吸收的离子对试剂量增大，离子交换保留机制为主，而反相保留机制为次要,初始实验,特殊离子对试剂的选择(强疏水性或弱疏水性)依赖于流动相强度%B,特殊问题,人工峰尽可能相近地匹配样品溶剂和流动相的组成，增大进样浓度、减小进样体积缓慢的色谱柱平衡阴离子试剂（如磺酸盐）用50-80%的甲醇水作清洗剂易于除去。季铵试剂需用50%的甲醇缓冲剂进行清洗。在用新流动相检查保留值重现性之前，应至少用20倍体积的清洗溶剂进行清洗。较差的峰形硅羟基温度,离子交换色谱,离子交换色谱（IEC）可用于包括生物来源的混合物（氨基酸、低聚核苷酸、肽、蛋白质、核酸）、无机盐和一些金属有机化合物因为IEC与离子对HPLC保留机制的相似性，许多可用IEC的分离也用IPC也可解决。用IEC原因：检测限制备分离多步分离,保留的基础,对于带电荷z的样品离子和一价的反离子，反离子浓度对其保留值的影响可总结为：,与固定相共价相连的荷电基团决定用于离子交换的色谱柱的特性：阴离子交换柱带正电荷，阳离子柱带负电荷。阳离子柱用于阳离子的分离，如质子化碱；阴离子柱用于阴离子的或酸性样品的分离,固定相用R（阳离子交换剂）或R（阴离子交换剂）表示，样品用X（阳离子）或X（阴离子）表示，IEC的保留过程：,pH影响,IEC一般用于酸性或碱性样品。阴离子交换色谱分离酸时，pH增大导致样品解离增多，保留值增大，而降低pH在阳离子交换HPLC中有利于碱的保留。（与RPC保留相反）改变pH通常是改变选择性的良好办法,盐或缓冲剂类型,阴离子交换色谱中，不同置换剂的相对强度顺序为：,阳离子交换色谱中转换剂强度顺序为：,有机溶剂,与RPC相同，流动相中加入有机溶剂会导致保留值下降,色谱柱类型,离子交换柱可分为4种：弱、强阳离子交换剂（WCX、SCX）与弱、强阴离子交换剂（WAX、SAX）强离子交换剂带有的离子基团在通常pH范围（2pH12）解离不改变。弱离子交换剂在一定的pH范围将失去电荷及样品的保留能力。离子交换色谱大多数的应用使用强离子交换剂,方法的建立,通常很少使用离子交换色谱同时分离样品阴离子和阳离子对于酸性或阴离子化合物，用强阴离子交换柱。对于碱性或阳离子化合物，用强阳离子交换柱pH6用于阴离子交换，pH6用于阳离子交换若已知样品的pKa值，阴离子交换时，要求pHpKa，而对于阳离子交换，则要求pHpKa缓冲剂浓度应比较低，如25mM，以避免与样品离子竞争保留选择B溶剂通过以下几种手段改善分离增加温度加入甲醇在能降低柱上电荷的pH下，用弱离子交换剂,硅胶柱,“原”硅胶色谱柱用于IEC分离强碱性化合物（pKa8）。流动相为90%甲醇/（硝酸铵缓冲液pH910），通过改变离子强度或pH来调节保留值。,
