科研项目的策划与实施医学科学研究入门PPT课件.ppt

,医学科学研究入门,李卓娅,(3)科研项目的策划与实施,科研项目的策划与实施,研究计划的安排科研准备工作和实验室安全实验的实施机遇灵感,组织策划,PI(principal Investigator)负责制分成若干课题组2-3个研究生完成1个项目制定并遵守实验室规则定期Lab Meeting：进展、开题报告、文献综述、学术讨论 跟踪课题进展；及时解决问题；提高工作效率 定期向导师汇报：进展、问题、下步计划Journal Club积极参加学术交流午餐（茶）聚会,学术讨论,旁人可能提出有益的建议，即使并未直接指出摆脱困境的解决方法，但由于知识背景不同，可能从不同角度观察问题并提出新方法。（琼脂）一个新设想可能由两三个人集中各自的知识或设想而产生。讨论是披露谬误的宝贵方法。以错误知识或推理为基础的设想可以通过讨论得到及时的纠正。讨论和学术交流是开拓思路、了解进展和信息交流的极好机会。讨论有益于摆脱重复不利的思路。与不熟悉本研究领域的人进行讨论，可能对打破固定思路更有帮助。（请教外行）,个人科研计划安排,开题报告：题目名称、背景、目的、研究内容、技术路线、实验方案、研究进度安排、预测结果、可行性分析研究时间（进度）计划安排：-总体时间安排：年度与学期安排-详细时间安排：月、周计划（充分利用时间）注意：提前半年至一年撰写并发表SCI论文中期科研报告：主要结果、存在问题和后续工作计划至少预留1-2个月的时间撰写学位论文,博士生个人计划学期安排,第一学期：上课；查阅课题相关文献；做课题相关综述；完成开题报告（科研设计和计划）；具体的方法学、数据等书面准备工作。第二至四学期：试剂、器材准备工作；方法学的摸索；预试和正式实验、中期科研报告；第五学期：继续实验；撰写并发表SCI文章第六学期：补充实验；撰写学位论文并答辩；第二至三学期、四至五学期各完成一篇论文。,科研项目的策划与实施,研究计划的安排科研准备工作和实验室安全实验的实施机遇灵感,科研实施原则,充分的准备工作，包括实验设计、实验材料、实验方法及观察指标等；制定操作规程，包括实验方案、操作程序、质量控制、仪器设备、标准化及标准操作规程等；规范原始记录，包括数据记录的准确性、完整性及更改数据的规范性，尤其是数据记录的原始性，牢记书面记录乃行为发生的凭证；审核监督，包括课题负责人对课题的监督管理、定期检查和结果分析等。,充分的准备-书面准备工作,实验方案及技术路线的设计确定可靠稳定的实验操作方法：确定实验体系；设立实验对照；选择质量控制标准（如系统误差允许范围、随机误差降到最低等）；选择实验器材；实验流程的可控性；判断标准的客观性实验材料的明细准备：书面汇集实验所需材料的名称、生产厂家、批号、规格及有效期等信息，同时查询各类试剂的配方、配制方法和保存条件等。上述信息有利于实验前准备，也有利于今后检索。实验分组的确定,充分的准备-实验准备,实验材料与器材的准备；基本操作的训练：试剂的配制和储存、试剂的标记和分类 样品的处理、标记、分装和储存 pH值的测定与调节、蛋白定量、核酸定量 加样器的正确使用 实验室常规仪器的正确使用；基本方法学的训练：细胞培养（冻存和复苏）、分子生物学、Western blot、FACS、免疫荧光与组化、ELISA,实验室的安全,水电煤气的安全性 用电设备的安全操作 玻璃仪器的安全使用 氧气瓶的安全使用 高压锅的安全使用 高温烤箱的安全使用,化学试剂的安全使用,使用易燃易爆试剂（如乙醇、乙醚等）须远离明火。挥发性有毒试剂一般须在通风厨中操作，且操作者须进行相应防护（如戴口罩）。接触性有毒试剂应戴手套操作，并避免用嘴吸或直接用手触摸。各种化学试剂均远离食品饮料，以防误食引起中毒。强酸、强碱类试剂须规范使用，不可过分震摇，以防溅出腐蚀伤人。,放射性同位素的安全防护,同位素的射线类型：X射线和射线可危害人体全身多个器官；射线因其穿透性小，仅危害皮肤浅表和眼晶体；射线一般不引起外照射危害 使用放射性物质的注意事项：放射性同位素的实验操作须在同位素乙级实验室中进行；放射性物质的存放方式要符合射线类型特点；放射性物质的标记须清晰，包括名称、含量及时间；放射性废物须按规定进行存放和处理；放射性实验的操作须进行相应屏蔽防护并在专门实验室中进行；放射性核素使用过程中对周围环境造成的污染须及时被处理；同位素实验室应配置放射性核素监测仪。,生物的安全防护,P1：普通实验一般在I级实验室中操作；P2：枯草杆菌、大肠杆菌、腺病毒等须在P2级实验室操作，并有防蚊要求；P3：烈性传染病相关病原研究须在P3实验室中操作；P4：烈性传染病的大动物模型实验须在P4级实验室中操作。P3和P4级实验室均须经国家级管理部门认证。,科研项目的策划与实施,研究计划的安排科研准备工作和实验室安全实验的实施机遇灵感,实验的实施,预实验：方法的熟悉；实验条件的摸索正式试验：实验条件和操作标准化，设计必要的对照，保证重复性，满足统计学的样本数。实验记录的正确书写和实验数据记录的保存实验结果的正确观察、分析和判断。,预实验的目的,在正式实验前所进行的小规模实验。,检查各项准备工作是否完善；确定实验操作方法是否正确可行；获得某些基础数据，确定合适的样本数和必要的统计学数据，以确保后续正式实验的顺利进行；摸索最佳实验条件；初步检验假说。,某课题在观察基因修饰的骨髓干细胞对Fischer 344大鼠骨髓重建影响的研究中，研究者仅参照文献报道中其他品系大鼠及小鼠骨髓抑制模型在建模时使用的钴60照射剂量，确定了照射方案，未经预实验而直接开始正式实验。结果在随后“正式”实验中，因所选照射剂量不适合该品系鼠，多数模型鼠在极短时间内死亡，故无法观察处理因素产生的效应结果。,预实验,实验方法的摸索：选择正确的实验技术（文献或实验方法书）详细阅读说明书参观他人做实验，并记下笔记自己写试验步骤配试剂和实验材料、器具的准备做实验。摸索条件的试验：如药物剂量的摸索、作用时间的摸索等。导向性实验：小规模试验验证正式实验的意义。筛选性试验：如药物筛选，用以决定哪种药物可进一步做实验。观测性实验：是为搜集正式实验所需数据（如均数、标准差及变异系数等）而进行的小规模预试，目的是对主要实验的部署进行指导。,以传染或毒性因子为例，在观测实验中,采用稀释度间隔很大(如100倍),用于每一稀释度的动物很少（如两头）的策略。取得结果后，在可能有作用的滴定终点两侧再选择间隔小(如5倍)的稀释度,同时使用较大数量的动物(如5只)。通过此方法，可用最少量动物而获得准确的结果。,实验的实施,预实验：方法的熟悉；实验条件的摸索正式试验：实验条件和操作标准化，设计必要的对照，保证重复性，满足统计学的样本数。实验记录的正确书写和实验数据记录的保存实验结果的正确观察、分析和判断。,正式实验,决定性试验：判断假说的成立与否根据预试验结果，选定实验条件，整个实验过程严格控制试验条件，一般不能随便改变，已避免试验结果的不可比。实验方法的标准化（步骤、试剂配制、浓度稀释等）设计各种必要的对照做好标签工作（老鼠、组织、切片、试管）必须满足统计学分析的足够样本数,Nat Immunol.2004 Nov;5(11):1124-33.,正式实验,决定性试验：判断假说的成立与否根据预试验结果，选定实验条件，整个实验过程严格控制试验条件，一般不能随便改变，已避免试验结果的不可比。实验方法的标准化（步骤、试剂配制、浓度稀释、仪器型号和参数等）设计各种必要的对照做好标签工作（老鼠、组织、切片、试管）必须满足统计学分析的足够样本数,实 验 误 差,系统误差：指一系列测定结果与真值之间存在同一倾向的误差，有明显规律性，可在一定条件下被重复，可通过质控预防和校正。（千分卡尺测量肿瘤）随机误差：属一种偶然、无法预料的误差，难以校正。过失误差：纯粹属人为的责任误差，一般通过实验室管理和技术培训可以避免。,控制实验方法质量的关键是规范意识！,实验操作规程的规范化,实验方法标准化的策略应首先明确(尤其对某些新的观察指标)规定标准化方法的流程，然后制定标准实验操作规程，对各个环节进行细化处理，保证实验人员可以不用询问即可遵照执行。,实验名称，对于具体课题的实验操作，名称应是特异性和具体的，勿仅标示通用性实验名称；实验目的；实验方法；实验流程，指在实验目的指导下的特定流程，每个具体步骤均应详细注明实验中实际应用的试剂名称或剂量等，避免通用性的实验流程；实验材料及仪器设备等。,标准物的选择：为建立标准实验体系，选择标准品，并在预实验中利用标准品确定各种实验条件（包括最佳剂量、最佳时间和判断标准等）。然后，以此数据作为测试样品的标准定量或定性参数。（蛋白定量、信号分子磷酸化）操作程序的控制：建立标准操作流程，实验操作人员仅进行机械性操作，无需任何想象、设计和预测，故要求在操作之间制定严密的操作流程和设计方案。（随机性是造成实验误差的最常见原因，如电话及其它无关事情的干扰；协调标准化和灵活性）试剂仪器的选择：实验过程中应采用同一厂商相同批号或相同规格的试剂，以基本保证不同批次实验的差异并非由试剂所致。仪器规格、型号也可能影响实验。,实验操作规程的规范化,正式实验,决定性试验：判断假说的成立与否根据预试验结果，选定实验条件，整个实验过程严格控制试验条件，一般不能随便改变，已避免试验结果的不可比。实验方法的标准化（步骤、试剂配制、浓度稀释等）设计各种必要的对照做好标签工作（老鼠、组织、切片、试管）必须满足统计学分析的足够样本数,实验的实施,预实验：方法的熟悉；实验条件的摸索正式试验：实验条件和操作标准化，设计必要的对照，保证重复性，满足统计学的样本数。实验记录的正确书写和实验数据记录的保存实验结果的正确观察、分析和判断。,实验记录的意义,利于总结工作并寻找实验中的差错。实验记录均须归档保存。若一旦出现问题需要审核，完整的实验记录将会提供最可靠的资料。完全依靠个人记忆绝非明智之举。将结果立即记录于实验记录本，而非日后耗费时间再重新回忆记录，以免遗忘某些重要的细节。了解早期所开展而当时并未受到重视的实验，可从以前的实验记录中获取信息和经验。实验记录是成功操作实验的关键。它应该是所做实验的完整记录。一本好的实验记录使人在很久以后还能重构当初实验的内容、过程、结果和教训。应养成详细进行实验记录的习惯。实验记录务求详尽、忠实，不仅本人一目了然，同行也能看得懂。实验记录的用途为：便于本人探究实验成败原因；供他人查找相关实验的重要信息；为撰写论文提供原始实验数据。,实验记录的内容,日期：包括年、月、日和时间，环境条件（如温度、湿度等）；实验名称实验目的实验材料：试剂（名称、批号、厂家、浓度、溶剂、保存条件）；仪器（名称、型号、供货厂商）；细胞细菌（名称、复苏、冻存、保存处）；动物（品系、来源、年龄、性别、数量）；临床标本（姓名、性别、年龄、诊断及其他临床资料）；试剂的配制实验方法：详细描述实验步骤 实验结果：包括所收集的原始数据、可视图及实验结果的整理。出现的问题：应分析其可能的原因及解决方法，并详细记录于实验记录本上。实验小结：简短的实验结果总结和解释，将有助于指导后续的研究。其内容包括主要结论、存在问题、改进方法和实验体会等,实验记录的书写要求-基本要求,实验原始记录须记载于正式实验记录本上，实验记录本应按页码装订；须有连续页码编号，不得缺页或挖补。实验记录本首页一般作为目录页，可在实验开始后陆续填写，或在实验结束时统一填写。每次实验须按年、月、日顺序在实验记录本相关页码右上角或左上角记录实验日期和时间，也可记录实验条件如天气、温度、湿度等。字迹工整，采用规范的专业术语、计量单位及外文符号，英文缩写第一次出现时须注明全称及中文释名。使用蓝色或黑色钢笔、碳素笔记录，不得使用铅笔或易褪色的笔（如油笔等）记录。实验记录需修改时，采用划线方式去掉原书写内容，但须保证仍可辨认，然后在修改处签字，避免随意涂抹或完全涂黑。空白处可标记“废”字或打叉。实验记录中应如实记录实际所作的实验；实验结果、表格、图表和照片均应直接记录或订在实验记录本中，成为永久记录。实验记录本应作为发表论文和实验室科技档案管理的必备文件。研究生毕业应在离校前将全部实验记录和其他科研资料上缴实验室保管和存档，不得随意处置或丢弃。,实验记录的书写要求-基本要求,实验原始记录须记载于正式实验记录本上，实验记录本应按页码装订；须有连续页码编号，不得缺页或挖补。实验记录本首页一般作为目录页，可在实验开始后陆续填写，或在实验结束时统一填写。每次实验须按年、月、日顺序在实验记录本相关页码右上角或左上角记录实验日期和时间，也可记录实验条件如天气、温度、湿度等。字迹工整，采用规范的专业术语、计量单位及外文符号，英文缩写第一次出现时须注明全称及中文释名。使用蓝色或黑色钢笔、碳素笔记录，不得使用铅笔或易褪色的笔（如油笔等）记录。实验记录需修改时，采用划线方式去掉原书写内容，但须保证仍可辨认，然后在修改处签字，避免随意涂抹或完全涂黑。空白处可标记“废”字或打叉。实验记录中应如实记录实际所作的实验；实验结果、表格、图表和照片均应直接记录或订在实验记录本中，成为永久记录。实验记录本应作为发表论文和实验室科技档案管理的必备文件。研究生毕业应在离校前将全部实验记录和其他科研资料上缴实验室保管和存档，不得随意处置或丢弃。,实验记录的书写要求-实验数据的记录,实验数据的记录须及时、准确、真实、完整，尽可能将原始数据记录到实验记录本上，严禁伪造或编造数据，并避免漏记和随意涂改。,图表：由自动记录仪打印的图表和数据资料应按顺序粘贴于记录本相应位置，若图表较多，可先将图表按顺序装订在一起，然后粘贴于记录本上。压边签字。热敏纸打印的数据，打印后立即复印，并将原件和复印件一并粘贴在实验记录的相应位置并压边签字。照片：各种照片直接粘贴于实验记录本相应位置，压边签字。细胞或病理组织照片须标记显微镜倍数、染色方式等信息。肿瘤照片须含标尺刻度。此外，照片背后应写明实验日期和处理因素等。相应组织切片存放位置、编号和名称等须记录于实验记录本相应位置，以便后续查找并重新分析。自成体系的表格记录：可单独装订成册，但须在实验记录本相应位置记录相关信息和存放位置及编号。电子板原始数据的记录：要有几处拷贝；可整理分析后打印粘贴，但实验记录本上须明确记录原始数据和图表的存放位置、标号含义等基本信息。扫描图片：各种扫描图片应粘贴于实验设计下方，其测定数据置于扫描图片下方，从而有助于参考图片分析数据。,各种操作流程的记录：各种操作流程均需记载于记录本上，简单的流程可直接记载，复杂的流程可打印后粘贴到记录本。摸索实验方法的记录：第一次引用某方法时应注明其出处。若首次使用某种成分或方法，应进行详细描述。凡摸索实验方法的记录均应尽可能完全，宜详细记录每一实验条件的确定过程，以便最后确定标准实验操作流程。须特别注意试剂的具体用量和浓度。一旦建立标准的实验流程，即可形成完整的protocol，日后进行同一实验流程时，除首次记录完整的protocol外，其余仅记载实验中改动的步骤，并表明所参照protocol的具体名称和出处即可。,实验记录的书写要求-实验流程的记录,实验记录注意的问题,实验记录不允许隔天写（未记录改变条件之例）以及写在纸片上。保持实验记录的真实性和完整性；记录时间（年、月、日）。原始数据（包括照片）必须贴在当天的试验结果栏里；不要保留在公共计算机里。即便是阴性结果，也必须保留。不能仅记录符合主观想象的内容和自认为成功的实验。定期整理、分析数据，并向导师汇报。养成实验后及时整理和分析实验数据的习惯，常会有意想不到的收获。,实验资料的保存,电子版资料：打印一份粘贴在实验记录本上或单独装订成册，同时保存电子版，并注意备份。例如，文字材料、各种结果的扫描图片、各种图表数据等。注意：扫描图片的像素须足够大，一般保证分辨率dpi300万；照片须标记放大倍数，如400；图片须进行必要标记，如Western blot扫描底片应标记日期、泳道、样品名称等。各种实验样品：用记号笔直接在管壁上标记仅适用于短期保存，长期保存须将写于管壁的字用透明胶覆盖，否则易在反复温度变化过程中脱色。最好的标记方法是将标记文字打印到双面胶布上，然后粘贴在管壁上。样品标记内容应至少包括日期、样品名称、浓度。实验记录本：应妥善保存，避免水浸、缺页，保持整洁无破损，避免丢失。实验结束后，原始实验记录本应由实验室负责人检查、签字后归档；实验人员可复制实验记录供本人使用，实验人员不得将实验记录原件带走。,实验的实施,预实验：方法的熟悉；实验条件的摸索正式试验：实验条件和操作标准化，设计必要的对照，保证重复性，满足统计学的样本数。实验记录的正确书写和实验数据记录的保存实验结果的正确观察、分析和判断。,观察中常见的问题,“留意意外之事”是研究工作者的座右铭。在观察的邻域中，机遇只偏爱那种有准备的头脑。观察中常见的问题：-受主观因素的影响：人工测量-忽视细节：曼切斯特医生教学-视而不见；“我们见到的只是我们知道的。”歌德 司空见惯、不了解或无兴趣的现象；某些既非意料之中、又非特地寻找的现象-虚假的观察：产生错觉；头脑本身滋生的（Goetingen心理学会）：头脑容易无意识地根据过去的经历、知识和自觉的意愿去填补空白。要学会观察不知道的和意料外的现象；有效的观察是指注意到某个事物，并通过将它和某个注意到的或已知的事物联系起来，赋予其意义；因此，观察既包含知觉因素又包含思维因素在内。,实验观察类型,自发观察或被动观察（即意想不到的观察）：为进行有效的自发观察，首先须注意某个事物或现象，将其与过去经验中的有关知识相联系，或在思考此现象中提出某种假说。（苹果掉地）诱发观察或主动观察（即有意识安排的观察）：通常是根据假说安排的观察。研究过程中，研究者常注重主动观察的现象，而忽视被动观察的现象。最好的办法是在观察实验过程中忘记自己的假说和预期结果。,实验观察的原则,客观性与真实性：客观地观察实验结果，避免对实验观察的倾向性和忽视意料之外的实验现象。（假说倾向性）实时性：实验结果的观察和收集与时间的选择有关，某些实验现象瞬间出现或持续时间很短，若错过最佳时间即难以被观察到。（信号分子磷酸化等）完整性：实验结果是否完整，可直接影响实验结论。（双峰曲线）,科学观察,“在研究工作中养成良好的观察习惯比拥有大量学术知识更为重要”“研究人员须运用其绝大部分知识和相当部分的才华，方能正确筛选出值得观察的对象。这是一个极为重要的选择，往往决定几个月工作的成败。”-格雷格 有效的观察指注意到某个事物，并通过将其与某个已知的事物相联系，赋予其意义。因此，观察既包括知觉因素，也包含思维因素。,培养科学观察习惯，提高科学观察能力,根据实验目的和设计进行实验操作，除观察某些主要变化及预期目标外，也有必要观察操作中的某些细微变化（Western)以及仪器设备的状况等。认真、细致、有始有终的观察习惯：在实验观察中，既须目的明确地观察实验结果，又须对可能发生的情况有充分估计和准备。有效的科学观察还须有良好的知识基础，只有熟悉正常情况，才能注意到不寻常或未加释明的现象。观察与思维紧密结合：观察是一种理性知识参与下的认知过程。,实验结果的分析和判断,结果的判断：实事求是，必须排除任何操作因素引起的误差；判断实验结果的正确性和可信性，具有统计学意义；对所得到的结果进行分析，要搞清该结果可能说明的一切问题，捕获实验结果中的全部信息；分析结果与结果之间的相互关系和内在的联系；,Quantitation analysis of TNF-induced apoptosis and necrosis by FCM,实验结果的分析和判断,结果的判断：实事求是，必须排除任何操作因素引起的误差；判断实验结果的正确性和可信性，具有统计学意义；对所得到的结果进行分析，要搞清该结果可能说明的一切问题，捕获实验结果中的全部信息；分析结果与结果之间的相互关系和内在的联系；,两型TNF体外杀瘤率,两型TNF体内抑瘤率,结果判断中常见的逻辑错误,不能读懂结果的全部信息；不能逻辑分析不同结果之间的关系；看表面现象，缺乏本质认识:TNFR1表达以先后而判断因果：慢支治疗与气候以臆想代推理：利血平与新药视“同时”为“相关”：脑猪囊虫病与乙型脑炎“先入为主”、“喧宾夺主”：银环蛇咬伤中毒致呼吸麻痹和休克；以偏概全、轻率概括：服用乌洛托品疣赘消失，引申出“乌洛托品可治疗人类癌肿”的结论。,预先激活TM-TNF-反向信号对 NK92细胞杀伤的影响,读出结果的全部信息,TNFR封闭肽对佐剂性关节炎腹腔巨噬细胞IL-1b mRNA的影响,封闭肽 正常 关节炎,野生型和C-28F突变型TM-TNF-a反向信号对I-kB降解的影响,I-kB,1 2 3 4 5 6,1：对照；2：sTNFR1；3：转染空载PCDNA3.0sTNFR1；4：转染C-28F突变型TM-TNF-a+sTNFR1；5：转染野生型TM-TNF-a+sTNFR1；6：转染缺失胞浆段TM-TNF-a+sTNFR1。,该结果提示什么？,1 对照；2 COS-7；3 转染空载PCDNA3.0；4 转染C-28F 突变TM-TNF-；5 转染野生型TM-TNF-,Realtime PCR,C-28F TM-TNF-突变体丧失诱导U937细胞转录iNOSmRNA的效应,该实验结果肯定的条件是什么？,Fig 4 Death mode switched from apoptosis to necrosis by memTNF-a mutant Y87F,Cleaved caspase-3,-cleaved PARP(89kDa),-actin,-19kDa,-17kDa,Wild-memTNF-,control(MCF-7),Y87F memTNF-,s-TNF,pcDNA3.0,-full length PARP(116kDa),C,样品排列不一致！,NF-kB activation of Raji cell decreased after lipid rafts disruption,After treatment of MCD,Raji cell were lysed and its lysis supernatant were used to NF-kB detection.NF-kB were detected by ELISA.,如何下结论？,mTNF expression vector were transfected to Hela cell,and then use this cell as effect cell to kill human EVC-304 cell.Hela+TNFwt was transfected with wild type mTNF,Hela+TNF(-47)was transfected with mTNF mutated on-47 which deleted the palmitoylated site.,Deletion of palmitoylated site has no effect on mTNF cytotoxity,该结果能否说明TNF不在脂筏里？为什么？,前后结果内在联系提示什么？,mTNF expression increased after MCD treatment.,Raji Raji+MCD,必须排除何种因素？如何排除？,免疫共沉淀,为何两种受体共沉淀的信号分子一样？,TNFR2抗体检测,TNFR1抗体检测,TNFR抗体交叉实验,科研项目的策划与实施,研究计划的安排科研准备工作和实验室安全实验的实施机遇灵感,机遇在新发现中的作用,巴斯德发现减毒病原体可以作为疫苗；细菌染色的最重要的方法是丹麦内科医生革兰发明的：他试图对肾切片双染，将细胞核染成紫色，微管染成棕色，故用了龙胆紫，接著又用了碘溶液。他发现这样处理过的组织，能用酒精使其迅速褪色，但某种细菌仍保持蓝紫色，故将之用以辨别不同的细菌。离体青蛙心脏在生理盐水中可保持跳动半小时。一次，英国伦敦大学医院的生理学家、内科医生林格发现他的离体青蛙心脏连续 跳动了好几小时。他非常惊讶，后来发现是他的实验助手在制作盐水溶液时用的不是蒸馏水而是自来水。根据这个线索就不难断定自来水中的哪些盐分引起了生理活动的增加。从而发现了格林氏溶液。,Louis Pasteur,1879,使大家吃惊的是：几乎所有这些家禽都经受住了这次接种，而先前未接种的家禽，经过了通常的潜伏期后则全部死掉了。这一点甚至连巴斯德自己或许也大吃一惊，他没有预料到这样的成功。,机遇只垂青那些懂得怎样追求她的人。查理.尼科尔,机遇在新发现中的作用,巴斯德发现减毒病原体可以作为疫苗；细菌染色的最重要的方法是丹麦内科医生革兰发明的：他试图对肾切片双染，将细胞核染成紫色，微管染成棕色，故用了龙胆紫，接著又用了碘溶液。他发现这样处理过的组织，能用酒精使其迅速褪色，但某种细菌仍保持蓝紫色，故将之用以辨别不同的细菌。离体青蛙心脏在生理盐水中可保持跳动半小时。一次，英国伦敦大学医院的生理学家、内科医生林格发现他的离体青蛙心脏连续 跳动了好几小时。他非常惊讶，后来发现是他的实验助手在制作盐水溶液时用的不是蒸馏水而是自来水。根据这个线索就不难断定自来水中的哪些盐分引起了生理活动的增加。从而发明了格林氏溶液。,德拉姆(H.E.Durham)博士记述了通过抗血清发现细菌凝集的经过如下：那是1894年11月的一个值得纪念的早晨，我们都准备好了要用法伊弗(Pfeiffer)提供給我们的培养液和血清去检验他做的活体内诊断反应。格鲁伯(Gruber)教授对我喊道：”德拉姆，这儿来，你瞧！”在用血清和弧菌的合剂进行第一次注射前，他取了样品放在显微镜下，看到了凝集。几天以后，我們要用消毒过的小玻璃罐制作合剂时，正巧小玻璃罐都没有消毒，所以我只好用消毒试管。放有培养液和血清混合物的试管插在那里片刻以后，我喊道：“教授先生，这儿来，瞧！”出现在他眼前的是沉积现象；就这样，我們得到了两种可用的方法：微观的和宏观的。这一发现出人意外，事先沒有提出过假说，这是在另一研究工作的过程中偶然发生的。由于偶然找不到消毒玻璃罐，发现了宏观的凝集现象。(承蒙迪安 H.R.Dean 教授示我以德拉姆的手稿),科研项目的策划与实施,研究计划的安排科研准备工作和实验室安全实验的实施机遇灵感,真正可贵的因素是灵感爱因斯坦,灵感用在这里是指对情况的一种突如其来的颖悟或理解，也就是人们在不自觉地想着某一题目时，虽不一定但却常常跃入意识的一种使问题得到澄清的思想。我决心放下工作，放下有关工作的一切思想。第二天，我在做一件性质完全不同的事情时，好像电光一闪，突然在头脑中出现了一个思想，这就是解决的办法简单到使我奇怪怎麽先前竟然没有想到。产生灵感最典型的条件是：对问题进行了一段时间专注的研究，伴之以对解决方法的渴求；放下工作或转而考虑其他；然后，一个想法戏剧性地突然到来，常常有一种肯定的感觉，人们经常为先前竟然想不到这个念头而感到惊奇或狂喜。灵感可出现在走路、坐车、睡眠中、吃饭、看文献、与他人交谈等日常活动和休息时间中，这些念头忽悠即逝，必须经常备用一个小本子，将它们记载下来。,灵感之梦,1864年的某个冬天，德国化学家凯库勒坐在桌前写作他的教科书，他叙述道：“但事情进行得不顺利，我的心想着别的事了。我把座椅转向炉边，进入半睡眠状态。原子在我眼前飞动：长长的队伍，变化多姿，靠近了，连接起来了，一个个扭动着，回转着，像蛇一样。看，那是什么？一条蛇咬住了自己的尾巴，在我眼前轻蔑地旋转。我如从电掣中惊醒。那晚我为这个假说的结果工作了整夜。先生们，让我们学会做梦吧！”凯库勒明白了苯分子是一个环就是现在充满了我们的有机化学教科书的那个六角形的圈圈。,1921年复活节星期天之前的那个夜晚，奥地利生物学家洛伊（Otto Loewi）从梦中醒来，想到一个极好的设想。他打开灯，抓过一张纸迷迷糊糊地写了些东西，倒下去又睡着了。早上6点钟，他突然想到，自己昨夜记下了一些极其重要的东西，赶紧把那张纸拿来看，却怎么也看不明白自己写的是些什么鬼画符。他在实验室里整整坐了一天，面对着熟悉的仪器，就是想不起那个设想。幸运的是，第二天凌晨3点，他又一次醒了过来，还是同样的顿悟，他高兴极了。这回他仔细地记录下来，这才回去睡觉。,次日，洛伊走进实验室，杀掉了两只不幸的青蛙，取出蛙心泡在生理盐水里，其中一只带着迷走神经，另一只不带。用电极刺激一只 心脏的迷走神经使 心脏跳动变慢，几 分钟后把泡着它的 盐水移到另一只心脏 所在的容器里，结 果心脏的跳动也放慢。经过几年的研究，Loewi发现这种物质的化学及生理学性质与乙酰胆碱完全相同，于是他断定迷走神经末稍释放的是乙酰胆碱（ACh）。,神经冲动的化学传递就这样被发现了，它开启了一个全新的研究领域，并使洛伊获得1936年诺贝尔生理学或医学奖。,实验的实施,5勤：勤看：看文献、看说明书、看别人试验、看实验对象勤问：问同学、问老师、问专家勤记：记笔记、记标记、记实验记录、记灵感勤想：想设计、想方法、想体系、想结果、想假说勤做：做预试、做实验（标准）、结果分析、制图,不想好不做，不准备好不做！不标准化不做！,