目的基因的克隆与鉴定.ppt

实验24 目的基因的克隆与鉴定,一、实验目的,学习和掌握细菌转化与目的基因DNA分子增殖及其鉴定的原理和方法。,重组DNA（基因克隆）示意图,重组载体的构建,二、主要仪器设备及器材,设备：低温离心机、恒温水浴器、台式离心机、超净工作台、琼脂糖凝胶电泳系统、恒温培养箱、高压灭菌锅、陶瓷研钵、吸头、紫外分光光度计、PCR仪、电泳仪、水平式电泳槽、微量离心管、紫外线透射仪。试剂：TRIzol TM试剂、高保真DNA 聚合酶混合物、Reverse Transcription System、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭、Tris、EDTA、SDS、pUCm-T载体、大肠杆菌、琼脂糖、T4 DNA连接酶。,三、实验内容与基本要求,1、用碱裂解法提取质粒DNA：方法同前。2、目的基因DNA分子的PCR扩增：方法同前。3、PCR产物的检测与回收：方法同前。4、质粒DNA与目的基因DNA分子的连接：利用pUCm-T载体构建T-A重组克隆。将上述PCR产物和质粒DNA，利用T4 DNA连接酶体系14连接过夜，获得连接产物。,三、实验内容与基本要求,5、在感受态细胞中加入连接产物转化入大肠杆菌BL21中，获得转化的感受态细胞：取感受态细胞悬液100L转移到无菌的微量离心管中,每管加连接产物10L，轻轻混匀，在冰上放置30min。42的循环水浴中2min。快速将反应管转移到冰浴中，使细菌冷却2min。每管加500L 无氨苄青霉素的LB培养液。37，200 rpm，培养1h。,三、实验内容与基本要求,6、已转化的感受态细胞涂板培养，观察并鉴定：将400L 菌涂在氨苄青霉素平板上。平板在37正向放置1h，以吸收过多液体，然后倒置平皿，于37培养过夜。挑取阳性克隆至含氨苄青霉素的LB培养液中，37培养过夜，小规模扩增后，用碱变性法制备质粒并鉴定。7、阳性克隆目的基因DNA分子的鉴定：挑取阳性菌落至含氨苄青霉素的LB培养液中，37培养过夜，小规模扩增后，用碱变性法制备质粒并鉴定。取阳性克隆菌液，采用PCR方法和鉴定阳性克隆。,超净工作台,高速冷冻离心机和超速离心机等,漩涡混匀器,垂直电泳装置,凝胶成像系统,四、实验结果报告,1、转化效率的计算：转化子总数菌落数（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）转化效率（每微克质粒DNA的转化子数）转化子总数（个转化子）/加入质粒DNA的量（g）2、质粒提取与酶切鉴定结果，贴上打印实验照片并标明照片上各DNA条带的含义。,五、思考题,1、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据是什么？2、CaCl2制备细菌感受态细胞及其转化的基本原理。3、阳性克隆鉴定的方法有哪些？简述,