目的基因的表达第五章-黑板.ppt

第五章 外源基因的表达（the expression of foreign gene),第一节 外源基因的表达体系,原核生物转录过程,RNA聚合酶亚基发现启动子序列与-35区结合 进一步与-10区结合 解链（17bp)使模板暴露 因子识别并起始启动位点 pppA/pppG 因子解离，NusA与RNA聚合酶结合（放松）RNA聚合酶向前滑动，继续解12bp链 终止（依赖因子、不依赖 因子）,一、基因表达的机制,外源基因的起始转录：可调控的启动子mRNA的延伸与稳定性外源基因mRNA的有效翻译（起始密码子、SD序列、SD序列与起始密码子之间的距离为39个碱基）表达蛋白在细胞中的稳定目的基因沉默(位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默、转录后水平的基因沉默）,二、外源基因表达系统,概念：目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并在其中有效表达，产生目的基因产物。原核生物基因表达系统(大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统和蓝藻表达系统）真核生物基因表达系统,原核基因表达系统,生长快，可通过发酵获得大量基因表达产物基因组结构简单，便于基因操作与分析多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性,大肠杆菌基因表达载体,复制子启动子和终止子核糖体结合位点密码子（简并密码子的选择）选择标记（抗生素抗性基因）,三、制约目的基因表达的因素,1、外源基因是否插入在正确的阅读框架2、目的基因的有效转录（如启动子的作用）3、mRNA的有效翻译（如SD序列等作用）4、转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程,四、阅读框架 在DNA链上,由蛋白质合成的起始密码开始,到终止密码子为止的一个连续编码序列,叫做一个开放阅读框架（open reading frame,ORF）五、启动子与转录的影响 1、在原核细胞的转录过程中，决定外源基因表达的关键因素是外源基因必须在载体DNA的启动子控制之下，而且启动子又能被宿主细胞中的RNA聚合酶有效识别。,选择填空,2、启动子DNA序列中两个高度保守区域是必须的（-10区与-35区），没有这两个高度保守区域，就没有启动作用。但是启动子DNA序列中保守性较差部分和两个保守区之间的核苷酸数量也影响启动子的功能。LacUv5 trp启动子 trp-lacUv5启动子,（1）原核生物：大约在RNA合成起点之前的10bp和35bp处，由两个由6个核苷酸组成的共有序列-10区：TATAAT（the pribnow box）-35区：TTGACA（2）真核生物-30区：TATA盒：TATAAAA-80区：CAAT盒：GGTCAATCT,六、翻译过程对表达的影响,1、SD序列与rRNA的16s亚基3末端序列之间的互补程度，是影响翻译效率的主要因素。2、起始密码AUG与SD序列之间的距离以及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力。3、起始密码之后的一个核苷酸对mRNA与核糖体的结合也有影响。4、基因末端的转录终止区的影响,第二节 外源基因在原核细胞 中的表达,一、基因工程的表达系统,1、克隆原核基因在原核细胞中表达2、克隆真核基因在原核细胞中表达3、克隆原核基因在真核细胞中表达4、克隆真核基因在真核细胞中表达,原核表达系统：大肠杆菌系统枯草杆菌系统 真核表达系统：低等真核细胞（酵母）系统哺乳动物细胞系统昆虫细胞系统,真核基因在原核细胞中表达的困难,1、细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。2、从真核基因转录的mRNA缺乏SD序列，不能结合到核糖体蛋白上。3、真核基因一般含有内含子，而原核细胞缺乏真核细胞转录后加工系统，mRNA中的内含子不能切除，成熟的mRNA不能形成，不能表达真核蛋白质。4、表达的真核蛋白质在原核细胞中不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏,2 起始密码子的正确选读 噬菌体蛋白A：5mRNA GUGAGUAUAAGAGGACAUAUGCCU 3 rRNA 5 ACCUCCUA 3 Q噬菌体复制酶：5 mRNA UUACUAAGGAUGAAAUGCAUGUCU3 rRNA 5 ACCUCCUA 3,二、原核系统高效表达外源真核基因 的措施,1、将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD 序列的下游2、从真核细胞中分离mRNA并反转录成cDNA3、将真核基因插在几个原核密码之后，通过翻译，通过翻译得到原核多肽和真核基因产物连在一起的融合蛋白。牛的凝血因子Xa能识别特异的4肽顺序：Ile（异亮）-Glu（谷）-Gly（甘）-Ary（精）原核多肽-Ile-Glu-Gly-Arg-真核蛋白。用Xa水解，分离出真核蛋白,4、减轻宿主细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平,将细胞的生长和外源基因的表达分开成为两个阶段，以便减低宿主细胞的代谢负荷,三、基因表达产物的检测与分离纯化,1、基因表达产物的检测1.1 外源基因转录产物的检测 Northern印迹杂交、RT PCR1.2 报告基因的酶法检测 氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)葡萄糖苷酸酶基因等(GUS)1.3 表达产物生物学活性检测,2、基因表达产物的分离纯化,细胞破碎 离心 沉淀法、超滤浓缩法分离特异表达蛋白 进一步分离柱层析 聚丙烯凝胶电泳,mRNA差异显示技术及其应用,一、mRNA差别显示技术概述,高等生物大约有3万5万个基因在任一细胞表达的基因约占总数的15%哪些基因在何生长发育阶段以及在何种生理状态下表达，决定了整个生命过程。比较同一类细胞在不同生长发育阶段的基因表达的差异，是克隆特异表达基因的方法。,一、mRNA差别显示技术概述,1992年Liang、PardeemRNA差异显示技术（differential display reverse transcripion PCR，DDRTPCR）动物、人类的癌症、心脏病、糖尿病植物胚胎发育、无融合生殖、植物抗逆与抗病性,二、DDRT技术的原理,（一）锚定PCR锚定PCR（anchored PCR）是PCR技术的一种改进，一般的PCR实验中需要知道目的基因两端的序列，而锚定PCR技术不需要。所谓的“锚定”就是指一端已经定死了，另一端通过人工合成引物来定，这就为许多我们对不清楚其5端区域或是3端区域的RNA的分析找到了一条良好的途径。,（二）DDRT技术路线,提取B组织RNA,提取A组织RNA,锚定引物（GT15A,GT15G,GT15C）反转录,锚定引物（GT15A,GT15G,GT15C）反转录,总RNA完整性鉴定,总RNA完整性鉴定,获得cDNA第一链,获得cDNA第一链,随机引物扩增获得cDNA第二链,随机引物扩增获得cDNA第二链,采用随即引物和锚定引物进行PCR扩增,采用随即引物和锚定引物进行PCR扩增,扩增产物进行凝胶电泳分析,处理 对照,将差异条带切出并进行回收,重新用相同的锚定引物和随即引物进行PCR扩增,Northern杂交，Southern杂交确定差异条带的真实性,克隆进入质粒载体,测序、进入GeneBank序列分析,三、mRNA差别显示技术的优缺点,1、优点 具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高 可同时比较多种给定生理状态或不同发育阶段的 细胞内mRNA2、缺点 1）所得特异性cDNA片段假阳性的比例高，75%原因：总RNA有DNA污染 凝胶中有重叠带 特异cDNA片段太短，得不到杂交信号,三、mRNA差别显示技术的优缺点,2、缺点 2）cDNA产物的质量往往较低，在凝胶上 呈现smear状态 3）得到的特异性的cDNA 片段非翻译序列 利用GeneBank进行数据分析不利,四、mRNA差别显示技术的应用,1、研究植物不同分化发育阶段的基因表达差异2、基因的鉴定与克隆3、研究激素对植物发育的影响4、植物抗逆性机理的研究5、在营养学中的应用6、在肿瘤研究中的应用,四、mRNA差别显示技术的应用,研究植物不同分化发育阶段的基因表达差异Ville Calzada和Nuccio 狼尾草的基因表达有性生殖和无融合生殖的子房2个锚定引物和20个10碱基随即引物共显示出2268个cDNA片段，其中有3个基因片段能在有性生殖的子房中特异表达。,四、mRNA差别显示技术的应用,在营养学中的应用 营养物质的作用与基因调空有关，当某种营养缺乏或过多时，在分子水平上就表现为某个或某些基因的开启、关闭或表达量的变化,铜在营养学中的作用,缺铜6周的大鼠肝脏mRNA,正常大鼠肝脏mRNA,10个cDNA片段的差异,表达量是对照的1.2倍,新的未知基因,五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用,被子植物无融合生殖使其子代继承了母本所有的遗传特性，并形成遗传上稳定的，可由种子繁殖的无性系。由此可以保存优异的基因型，固定杂种优势，并可能使一些重要的作物实现“一系法”育种；如果无融合生殖被很好地利用，它将是二十世纪六十年代“绿色革命”之后的又一次农业革命无性生殖革命。,五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用,植物界中，无融合生殖广泛存在。我们通过栽培甜菜（Beta vulgaris L.）与白花甜菜（B.corollifora Zoss）远缘杂交获得了真实杂种，经遗传回交获得了带有白花甜菜染色体的完整单体附加系系列，并且通过单体附加系传递研究，筛选出近100%高频率传递的单体附加系M14品系。经过标记基因杂交、传递遗传形态观察、胚胎学及分子生物学鉴定它们是兼性无融合生殖的,1999年3月经专家鉴定为无融合生殖品系；同时无融合生殖基因已经定位在这条附加的白花甜菜染色体上，因此M14品系是克隆无融合生殖基因的极为难得的材料。,甜菜单体附加系M14品系(VV+1C,2n=19=18+1,箭头所指为附加的白花甜菜染色体),五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用,采用mRNA差异显示技术比较甜菜无融合生殖系及正常进行有性生殖的二倍体栽培植株在无融合生殖基因表达的三个关键时期，即大孢子母细胞减数分裂期、助细胞提前退化期、次生核自行分裂期mRNA的差异，是进行克隆无融合生殖相关基因的比较有效的方法,五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用,对总RNA进行逆转录反应，合成cDNA第一链。PCR反应扩增：cDNA第一链 1ul 2.5mM dNTP 1.2l 25mM Mgcl2 1.2l Ex Taq酶（5U/l）0.2l 50m锚定引物 0.5l 随机引物 1.0l 10PCR 缓冲液 2.0l H2O 12.9l 反应体系为20ul,五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用,PCR反应程序：94,5min;94,30sec;42,lmin;72,30sec,40cycle。PCR产物利用4%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，分离出M14与A2Y相比较而对应的差异片段。将差异片进行回收、转化。克隆载体为 PMD18-T Vector，按照-互补筛选原则，挑取部分白色菌落为模板，按原程序进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析，有插入片段的菌落应扩增出一条与插入片段大小一致的片段，挑取阳性克隆菌落，穿刺培养后由上海博亚生物技术有限公司测序，测序后进入GenBank进行序列同源性比较。,经与GenBank数据库比较，发现AP-3片段与B.Vulgaris mRNA for small GTP-binding protein 具有同源性。种蛋白基因被称为分子开关，但是否与无融合基因的表达有关，需要进一步研究而AP-4为未知基因而。,