病毒学研究方法简介.ppt

第八章 病毒学研究方法简介,生物安全实验室,P1实验室研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松；P2实验室研究的是中度危险的病原，像肝炎、流行性感冒等等，要求戴防护性较好的口罩；P3实验室研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没有疫苗，试验人员的保护措施要比P1/P2实验室严密得多；P4实验室全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度危险的病毒，如令人谈之色变的埃博拉病毒、马尔堡病毒，进入这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上这种管子，然后才能呼吸。,根据微生物及其毒素的危害程度不同，分为级，一级最低，四级最高。,病毒学研究的主要方法,生物学特性测定:在寄主上的反应症状、传播等病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体分子生物学技术：核酸分子杂交、PCR等,一、生物学特性测定,在寄主上的反应 寄主范围、症状表现、传播方式等 病毒的理化性质 病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、体外存活期等 病毒接种方法 注射接种、病毒组织培养技术 植物病毒汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁 接接种、菟丝子接种法等,巨细胞病毒感染细胞的典型“猫头鹰眼”样核内包涵体,冠状病毒感染“非典”X线胸部检查可见肺部不同程度的片状阴影，少数病人进展迅速，呈大片状阴影，大多数为双侧改变，阴影吸收消散较慢。,TMV transmission by an Apis sp.,A severe mosaic symptom on tomato leaf(TMV),腿色斑Chlorotic spoting,黄化Yellowing,病毒检测,斑驳Mottle,脉明症Vein-clearing,条斑Leaf streak,腿色斑驳Chlorotic mottle,yellow dwarf,变色,seed coat mottling,郁金香碎锦花叶病,花变色碎色症color breaking、花瓣变绿virescence,杂色花郁金香、香石竹、紫罗兰、虞美人、唐菖蒲,Testing for Soybean Viruses with Indicator Plants,HypersensitivitySome plants are predictably sensitive to a specific virus.The hypersensitive plants are called indicator plants,and are used as a bioassay to test for the presence of virus in an unknown sample,1,Materials:gloves,sterile cotton swabs,rinse bottle,tissue grinding bags and carborundum-silicon carbide which is used as a tissue abrasive,2,Plant sap is made from the plant to be tested for virus by pulling off a symptomatic upper leaf,3,placing the leaf in a sterile plastic bag.adding buffer solution to the bag.grind the leaf tissue to release the virus particles into the buffer.,4,sprinkle a bit of carborundum on the plant to be inoculated.Just a light dusting is sufficient to provide enough abrasion to introduce virus into the plant cells.,5,inoculate the indicator plant,a cotton swab is immersed in plant saprub the surface of the test plant leaf firmly,but not with enough force to tear the leaf,6,7,rinse off the carborundum excess sap from the leaf with water to remove compounds that could interfere with the infection process,8,The indicator plants are placed in the greenhouse and checked daily for symptoms.If characteristic symptoms appear,we know that virus particles were present,卵黄囊接种：用58d鸡胚，以细长针由气室端刺入卵黄囊，孵育后收集卵黄囊膜检查。常用于一些嗜神经病毒羊膜腔：用1214d鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次分离尿囊腔：用912d鸡胚，将标本接种于尿囊腔，孵育后取尿囊液检查。常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等绒膜尿囊膜：用1012d鸡胚，无菌下开一小窗，将材料滴在绒毛尿囊膜上，孵育后观察膜上有无斑点病变。常用于培养单纯疱疹病毒，天花病毒和痘病毒,鸡胚接种,绒毛尿囊膜衰现痘病毒特异性损伤,要证明某种疾病是某一感染因子所引起则必须满足Rivers法则：从患病者体内分离出病毒；在实验动物或寄主细胞中可以培养；证明这种培养物具有滤过性；在原始宿主或相关种内能产生同样的病症；能重新分离出病毒。病毒的分离与鉴定组成了病毒学诊断技术的主体。病毒分离(virus isolation)是诊断病毒感染的“金标准”(goldstandard)。,二、病毒的分离与培养,标本采集和运送,时间：发病早期部位：视发病规律和病程而定运送：立即送检 4 保存或-70（长期保存）不泄漏、传播、填写详细标签分离与鉴定：,二、病毒的分离与培养,二、病毒的分离与培养,提纯extraction/纯化purification 二元培养法,（一）病毒的纯化与提纯,一般纯化方法动物病毒的纯化：从空斑、病斑分离，用终点稀释法植物病毒的纯化：如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则接种到适当寄主上；如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。,二、病毒的分离与培养,混合感染的病毒分离,1、根据病毒的性状、选择不同的寄主或根据病毒钝化温度和稀释终点的差异，如：PVX在千日红上引起局部病斑 PVY在酸浆草上形成局部病斑，蔓陀罗对PVY免疫 TMV 钝化温度90以上 CMV钝化温度在6070（汁液接种前高温处理.)2、虫媒传染：PVX不可由虫媒传，PVY可由桃蚜传 不同种的虫媒或获毒饲育时间和持久性的长短3、果树等木本植物病毒，如找到草本寄主和传毒虫 媒可用草本寄主纯化、繁殖、分离,二、病毒的分离与培养,病毒纯化中的必要参考属性：1.稀释限点(dilution end point,DEP)抽提液稀释到最后一个尚有侵染力的稀释度2.钝化温度(thermal inactivation point,TIP)病毒在未加处理的抽提液中，在某一温度时暴露10min而达到完全钝化3.体外存活期(L)病毒在抽提液中放在2022条件下，能保持多少时间的侵染力。4.沉降系数与分子量沉降系数S在20下1达因的引力场中的沉降的速度（cm/s)常用1000，植物病毒在50几千S,二、病毒的分离与培养,（二）病毒提纯的原理,1、破碎寄主细胞低速离心(100010000g，515min)去除较大的组分叶绿体、线粒体、淀粉颗粒、细胞壁碎片等，中间组分如植物蛋白、核糖核蛋白体、微粒体(内质网膜的小碎片)等较难去除。2、提纯病毒的原理,二、病毒的分离与培养,（1）大多数病毒的外面主要由蛋白质组成（2）病毒的大小、形状和密度适合在大约40000g 重力下沉降,常用试剂：1、适当的缓冲剂：保护病毒，不变性磷酸盐、硼酸盐、Tris-HCl等（种类、浓度）2、还原剂：防止病毒因氧化而钝化、抑制酚氧化酶巯基乙醇/酸、亚硫酸钠、抗坏血酸、半胱氨酸3、溶剂：蛋白质、脂类变性剂，使组织抽提液澄清正丁醇、氯仿、乙醚等4、鳌合剂：EDTA等 可除去寄主中的核粒，与二价阳离子结合防止病毒粒子团聚和多元酚氧化5、其他添加剂：活性碳、膨润土 吸附除去核粒和色素等,（三）病毒提纯的技术,二、病毒的分离与培养,1、差速离心和密度梯度离心 差速离心：交替使用高速和低速离心高速离心（4000080000g）使病毒沉淀，取沉淀低速离心（约4000g）仅去除大的细胞碎片等杂质，取上清 密度梯度离心：部分或完全根据颗粒在一个无对流介质中的密度而获得分离 蔗糖10%40%CsCl等,（三）病毒提纯的技术,二、病毒的分离与培养,2、沉淀法 简便快速但粗糙易变性盐析法 硫酸铵浓度达3050%饱和度时多数病毒沉淀等电点沉淀 加醋酸或盐酸丙酮沉淀 浓度达4070%聚乙二醇沉淀 浓度达48%乙醇沉淀 浓度达20%沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸 铵沉淀3、吸附法 磷酸钙、离子交换树脂、羧甲基纤维素4、酶处理 许多病毒抗蛋白酶和核酸酶,（三）病毒提纯的技术,二、病毒的分离与培养,5、有机溶剂萃取有机溶剂可溶掉脂肪、有色杂质或非病毒的变性蛋白，如脊髓灰质炎病毒提纯中用正丁醇：要考虑病毒对有机溶剂的耐受性,（三）病毒提纯的技术,脂肪,变性非病毒蛋白,病毒,水,醇,二、病毒的分离与培养,6、电泳法 普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等7、柱层析法 吸 附：用离子交换或吸附法 分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱8、抗血清处理 针对寄主蛋白的血清来沉淀杂蛋白 加病毒的抗血清形成病毒抗体复合物,（三）病毒提纯的技术,二、病毒的分离与培养,硫酸铵沉淀法,（四）植物病毒提纯举例1,PVX病植株汁液,澄清的汁液+饱和硫酸铵2：1,去上清，沉淀悬浮在生理盐水或buffer,静置30min11500g 离心 10min,流水透析2h，buffer或生理盐水透析1夜,3800g 离心 10min，去杂质,也可低速离心,提纯的病毒悬液可直接使用，也可进一步重复沉淀提纯,弃沉淀，上层即为提纯的病毒悬液,超速离心法,（四）植物病毒提纯举例2,CMV病叶+buffer+巯基乙酸，匀浆,500g 离心 15min，留上清液,80000g 离心30min,留沉淀+缓冲液,澄清液+聚乙二醇，溶解后静置30min（沉淀病毒）,低速离心10min（5000g)保留上清液,超速离心 150min(75000g)留沉淀，缓冲液悬浮,15000g 离心20min,保留上清液,上清液即为提纯的病毒悬液，也 可 重复进一步提纯,动物培养 鸡胚培养 组织培养原代细胞：新鲜组织+胰蛋白酶消化，分散+培养液 成单层细胞二倍体细胞株：原代细胞传代（为二倍体细胞）传代细胞系：肿瘤组织或二倍体细胞自发转化（非整倍体）,动物病毒的培养,二、病毒的分离与培养,病毒学研究的主要方法,生物学特性测定:在寄主上的反应症状、传播等病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体分子生物学技术：核酸分子杂交、PCR等,标本制备 浓缩标本有以下几种方法：超速离心 离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心机转头的半径，一般是30min到3h沉淀的样本用灭菌蒸馏水洗后再放到铜网上；超过滤法 用于分子筛的蛋白质相对分子质量为10000；接种细胞 接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；免疫凝集 如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩病毒,三、病毒的光镜与电镜观察法,光 镜：寄主组织切片、包含体,三、病毒的电镜观察法,1、正染法（超薄切片法、病组织）将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，通常12 d完成。操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过程。2、负染法直接将病毒悬液(也可用细胞)滴在铜网上，用重金属(通常用磷钨酸)进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上显示亮区较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。缺点：敏感性低，要求病毒量在107mL以上，同科病毒难于鉴别。3、投影技术4、胶体金标记技术、与免疫学技术结合等,采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态,Orf virus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎),Ebola virus埃博拉病毒（正染技术）,Vaccinia virus 痘苗病毒（投影技术）,负染技术,美国疾病控制和预防中心公布的一张未标明日期的彩色电子显微照片。它显示出H5N1型禽流感病毒（金黄色）在MDCK细胞（绿色）培养液中的活动状态,电镜技术的应用,研究病毒形态、鉴定 观察病毒的形态及形态发生学过程；亚显微结构；病毒与宿主细胞的关系；病毒感染细胞的超微结构改变；病毒的分类等。诊断病毒病 检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用电镜最先发现的能进一步发现新的病毒和病毒病。,四、免疫学技术,1、病毒抗原2、病毒抗体3、免疫学诊断方法免疫荧光法(IF)免疫酶法（ELISA）单克隆抗体技术,血凝抑制（HI）试验,血凝试验HA,琼脂扩散试验,五、分子生物学技术,核酸分子杂交技术PCR技术基因检测技术的应用,本章要点,病毒学研究的主要技术与原理,