生物制药学第三章基因工程制药.ppt
第三章 基因工程制药,第一节 基因工程药物生产的基本过程,DNA重组药物制造的主要步骤,获得目的基因,DNA的体外重组（切与连）,载体的选择受体细胞的选择,重组DNA分子转化（转）,转化子的筛选与鉴定（选）,外源基因的大规模表达和分离纯化,产品的检验和制剂制备,基因工程制药过程,上游部分下游部分,上游主要程序,目的基因的获得和克隆重组载体的构建重组载体转入宿主细胞外源基因在宿中细胞中的表达表达产物的检测,下游主要程序,工程菌的发酵目的蛋白的分离纯化逐步加工成药品,第二节 常用表达系统,一、大肠杆菌表达系统,载体要求有自主复制起点筛选标记启动子，能被RNA聚合酶识别终止子翻译起始信号多克隆位点,pBV220系统pET系统,pBV220质粒,菌株DH10BJM109DH5,pET质粒,菌株BL21DE3,二、酵母表达系统,原核筛选标记真核转录和表达元件，包括启动子、终止字、翻译起始信号真核复制起始位点或整合位点真核筛选标记载体要求原核复制起始位点,啤酒酵母表达系统毕赤酵母表达系统 裂殖酵母表达系统汉逊酵母表达系统,Invitrogen公司的pYES2质粒，含2复制序列和pUC复制起点，Amp和Ura筛选标记，GAL1启动子和CYC2终止子 pPIC9K全长9.3Kb，原核有氨苄和卡那抗性，真核中是组氨酸和HG418筛选标记，有和染色体重组的整合位点，在多克隆位点的上游有信号肽序列，用甲醇诱导表达,pYES2,半乳糖激酶启动子,pPIC9K,甲醇氧化酶启动子目前已发现的、最强的真核启动子,第三节 基因工程制药上游技术,一、目的基因的获得,1.化学合成法在核酸合成以上可以自动合成一条单链的寡聚核苷酸，准确率比较高，但是费用也高,2.PCR法如果知道基因序列，且基因没有内含子，就可以通过合成引物，通过PCR的方法人工合成基因 3.逆转录法对有内含子的基因常采用的方法，具体工程为：提取细胞或组织的总RNA，用逆转录酶和OligodT合成cDNA的第一链，再通过PCR方法合成第二连,二、目的基因的克隆,一般是将目的基因连接到T载体上，但有时候这一步可以省略,三、基因的体外重组,双酶切T载体和表达载体，体外连接,四、重组产物转入到宿主菌中,体外连接的产物，用合适的方法转入到宿主菌中，如用氯化钙或电转化法转入到大肠杆菌中，酵母的转化还要经历大肠杆菌阶段,五、外源基因的表达,根据启动子的类型，采用不同的表达条件，如pET系统，用IPTG或乳糖诱导，pBV220系统采用温度诱导，毕赤酵母用甲醇诱导,六、目的蛋白的检测,一般采用活性试验和/或电泳菌体总蛋白质,第四节 基因工程制药上游过程实例,实例一,引物，PCR扩增PCR产物连接到T载体上转化到大肠杆菌T载体双酶切 表达载体双酶切体外连接转化到大肠杆菌提取质粒转化到表达宿主菌诱导表达电泳检测蛋白,实例二,引物，PCR扩增PCR产物连接到T载体上转化大肠杆菌T载体双酶切 表达载体双酶切体外连接转化大肠杆菌提取质粒转化到酵母中活性检测,实例三,鲨鱼肝总RNAOligodT 逆转录第一链鲨肝活性肽N端序列，OligodTcDNA双链连接到T载体上双酶切T载体和表达载体体外连接两个片段转化到大肠杆菌中测序，与多肽序列对照诱导表达电泳检测分子量，活性试验,第五节 基因工程菌的稳定性,工程菌的不稳定性大多数是由于质粒不稳定造成的,一、工程菌的稳定性质粒分裂的不稳定:工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象质粒结构的不稳定:指外源基因从质粒上丢失或者碱基重排、缺失而导致的工程菌性能的改变,1.质粒不稳定产生的原因,含质粒菌产生不含质粒菌的比率两种菌的比生长速度差异的大小插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构,2.提高质粒稳定性的方法,两阶段培养法发酵工艺条件的优化选择合适的宿主菌或质粒增大选择压力固定化技术,两阶段培养法,菌体生长的一定阶段的时候，进行诱导表达大肠杆菌的pET系统毕赤酵母,发酵工艺条件的优化,通过适当发酵工艺，可以提高质粒的稳定性，可以间隙改变发酵的环境参数，如温度、溶氧量、酸碱度等,选择合适的宿主菌或质粒,根据表达蛋白的性质，选择合适的宿主菌和质粒搭配pET系统中的宿主菌有BL21、DE3、DH10B等，质粒有pET3、5、12、14、17、21、22、25、28、32、34、40等 相对而言，Kan抗性的质粒一般比Amp抗性稳定,增大选择压力,Amp的工作浓度一般在50g/ml，发酵培养是可以加大到200g/ml,固定化技术,将细胞固定在载体上进行培养,第六节 重组蛋白高表达策略,一、大肠杆菌表达系统,1.外源基因的拷贝数2.外源基因的表达效率3.表达产物的稳定性 4.细胞的代谢负荷5.发酵条件的优化,外源基因的拷贝数,一般情况下，菌体内质粒的拷贝数越多，外源基因就越多，转录的RNA也就越多，翻译出来的蛋白也就越多,外源基因的表达效率,就目前人们的认识水平，许多因素影响外源基因的表达效率启动子核糖体结合位点SD序列起始密码子ATG的距离密码子的组成,表达产物的稳定性,外源基因在大肠杆菌中表达，表达产物对宿主菌而言，是异物，所以大肠杆菌体内常会产生一些蛋白，消化表达产物，采用融合表达，分泌表达，点突变（改变外源蛋白的酶切识别位点），选用蛋白酶缺陷型的宿主菌,细胞的代谢负荷,大量复制质粒和表达外源基因，会破坏宿主菌原有的代谢平衡减轻细胞代谢负荷的一个方法是菌体的生长和表达外源基因分为两个阶段,发酵条件的优化,二、酵母表达系统,1.外源基因的拷贝数相对于大肠杆菌，酵母的质粒要少得多，而整合型的质粒，如毕赤酵母，由于拷贝数可以比较高，所以现在用地非常普遍 2.外源基因的表达效率1）启动子2）分泌信号的效率3）终止序列的影响4）偏好密码子的使用,3.外源蛋白的糖基化4.宿主菌的选择1）生长力强2）内源蛋白酶活性弱3）菌株性能稳定4）分泌能力强,5.发酵条件的优化,工程菌表达药物蛋白，表达量越高越好？,高效表达的目的蛋白 无活性无法有效复性美国每年损失几十亿,第七节 包含体,包含体（包涵体）：又称光折射体，大肠杆菌高量表达外源基因时，大量的表达产物和DNA碎片、RNA、核糖体等结合在一起形成的一种颗粒 包含体中的蛋白质一般是不正确折叠的蛋白，特别是二硫键的错配,酵母表达系统包含体？,一、减少包含体的策略,发酵温度分泌表达选用合适的宿主菌和载体稀有密码子,二、包含体的复性,盐酸胍、去污剂（Triton）等处理蛋白变成完全随机的结构除去变性剂重新折叠成结构活性的蛋白,三、包含体复性方法,溶液中复性反胶束环境复性分子伴侣固相复性,第八节 分离纯化实例,基因工程表达一药物蛋白研究阶段和生产阶段分离纯化策略,重组类人胶原蛋白,胶原是结缔组织的结构蛋白胶原蛋白是在提取胶原时，结构没有改变的一类蛋白,羟脯氨酸,重组类人胶原蛋白是通过逆转录在人体中钓取基因后，进行了某些位点的突变，并在大肠杆菌中表达的重组蛋白分子量70，000方法：亲和层析纯化,发酵后的工程菌，5000r/min离心30分钟质液比1：6将菌体悬浮于细胞破碎缓冲液中（1mmol/LEDTA,5mmol/LTris）冰水浴中超声波破碎仪间断超声十次，每次90秒,破碎液于4，5000r/min离心1小时，收集上清液,上清液用硫酸铵分级沉淀收集15%65%饱和度的蛋白质沉淀,沉淀溶解在缓冲溶液中（20 mmol/LTris-HCl，pH8.0）截流分子量30，000的超滤膜脱盐浓缩,脱盐的样品和平衡缓冲液（1mmol/LNaCl）1：1混合层析柱用锌离子充分螯合，并用10倍体积的平衡缓冲液平衡,上样后，平衡液冲洗，挂柱100 mmol/L的NH4Cl洗脱,76,包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）,第十节 基因工程药物介绍,一、重组胰岛素,胰岛素的作用是降低血糖浓度，达到治疗糖尿病的目的 猪胰岛素,不良反应1982年开始，美国等批准用DNA重组技术生产的人源化胰岛素 三种生物合成胰岛素的方法,(a)AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通常只有1020(b)人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80以上 目前Ely Lily用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素，其经济效益相当可观。(c)AB链同时表达法,1957年Isaccs等发现病毒干扰现象，即病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干扰病毒复制，因而命名为干扰素。根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物活性等差异，可分为、等3种，其中IFN-为多基因产物，有23种以上的亚型。,二、重组干扰素,上个世纪50年代末期临床应用，从血液中直接提取 70年代，直接从供血的白细胞中直接提取 目前一般采用大肠杆菌表达系统生产干扰素可以明显地抑制胸腺癌、某些淋巴肿瘤和多发性骨髓瘤，还能抑制骨髓型肉瘤手术后肿瘤的复发,三、重组水蛭素,1884年，John Haycraft发现了医用水蛭的提取物中含有抗凝血的物质 1957年，德国的Fritz Markwardt 从医用水蛭的唾液腺中分离纯化出这种抗凝血的物质，并命名为水蛭素 水蛭素现在已经能用大肠杆菌和酵母进行生产,
