基因工程的基本步骤.ppt
课题导入：,请从基因工程的概念思考获得“蓝色妖姬”的基本操作程序,1.2基因工程的基本操作程序,目标引领：,1、能说出基因工程基本操作程序的四个步骤2、能准确描述获取目的基因的方法3、能说出基因表达载体的具体元件,独立自学：阅读教材P8-10思考：,1、基因工程的基本操作程序包括那四个步骤,2、何为目的基因，获取目的基因的方法有那几种？,3、何为基因文库，有几种类型，如何构建？它们之 间有何区别？,4、PCR技术的具体过程包括几步，需要哪些条件？,6、基因表达载体构建的目的是什么？应包括那些具 体元件？,5、人工合成目的基因如何进行？,引导探究：,1、为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取行吗？,2、为什么cDNA文库中的基因不含有启动子和内含子？为什么基因组文库中的基因只有部分能进行物种间基因交流？,3、PCR技术扩增目的基因的方法应具备什么条件？,4、如何构建基因表达载体？,5、基因表达载体各元件分别有那些具体作用,1.2基因工程的基本操作程序 第二课时,目标引领：,1、能说出目的基因导入受体细胞的基本方法2、能准确描述目的基因检测与鉴定的方法和步骤,独立自学：阅读教材P10-15思考：,1、何为转化？将目的基因导入不同受体细胞的方法 一样吗？请举例说明,2、如何确定转化成功？需要确认那些信息？用什么 具体的方法？,引导探究：,1、农杆菌有何特点，农杆菌转化法的原理是什么？用 文字和箭头写出具体过程,2、根据农杆菌可以将目的基因导入双子叶植物的机理，你能否设计一个方案将一个抗病基因导入单子叶植物中？,3、请用文字和箭头写出显微注射法的具体过程,4、作为受体生物原核生物有何优点？请用文字和箭头写出目的基因导入原核细胞的具体过程,5、请具体描述各种检测和鉴定方法的具体操作过程,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：抗虫性、抗病性等,目标升华,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,一、目的基因的获取,（一）、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,1、从基因文库中直接获取,（1）基因文库：概念见P9,（2）基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类,种类,基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,（3）基因文库的构建方法,1、直接分离法(鸟枪法),某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,2、反转录法：cDNA的合成流程图解,（4）两种基因文库的区别,过程,高温变性（解旋为单链）,低温退火（引物与单链互补结合）,适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）,重复循环,预变性（增加DNA变性的概率）,2、利用PCR技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸(dNTP),引物：,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA(需含有目的基因),条件：,缓冲溶液,寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA）,双链DNA(即目的基因),反转录,合成,1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,3、人工合成的目的基因,二、基因表达载体的构建 基因工程的核心,1、目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2、基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA.将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法:,抗原抗体杂交,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,
