基因工程原理第七章.ppt
第七章 动物细胞基因操作,动物细胞基因操作,动物细胞基因操作的必须性:可进行细菌和真菌细胞所无法进行的真正的翻译后修饰载体 1)非复制质粒载体 2)带有病毒复制子的质粒 3)病毒转导载体细胞：与细胞本身特性、载体、转移、应用相关转移：转移技术、瞬时与稳定转染、共转染应用：细胞研究、蛋白表达、体内基因治疗、转基因动物,第一节 动物细胞DNA转移技术,动物细胞基因转移的途径=转基因技术,直接DNA转移：外源DNA通过物理转化直接进入细胞 如显微注射、含DNA颗粒轰击、转染：化学转染技术、脂质体、电穿孔转导：通过动物病毒包裹，利用病毒可以自然感染细胞并将自身核酸分子转入细胞的能力。,转染技术,化学转染技术(利用胞吞作用)1)DNA/磷酸钙共沉淀法 适用于单层生长细胞，不适用于悬浮或成团生长的细胞 对某些细胞有毒性，难以转染2)二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)可溶性聚阳离子制剂，不能用于形成稳定的细胞系脂质体(利用胞吞作用)低毒性，易操作，效率高，适用细胞类型多，甚至可转染活体细胞电穿孔(利用电脉冲在细胞膜上形成瞬时的纳米大小的孔）,转移后DNA的命运,具备在宿主细胞内发挥功能的复制起始子，可以稳定复制(稳定转染)可以整合到基因组DNA上，稳定复制(稳定转染)不具备在宿主细胞内发挥功能，也没有整合到基因组DNA上，瞬时保留(瞬时转染）DNA转入细胞的效率远高于DNA整合的效率两个物理上不相连的基因可以发生共转染，甚至可以都整合到基因组DNA上,第二节 动物细胞载体,动物细胞载体,非复制型载体 瞬时转染的载体(启动子功能分析的载体)选择标记DNA带有病毒复制子的质粒 SV40、BPV、EBV病毒转导载体 腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、Lentivirus等,瞬时转染的非复制型载体,载体无法复制，也不整合于基因组上在宿主细胞中往往只能保持1-2d的稳定可以进行基因的表达载体上往往具有报告基因，能够报告表达的发生,启动子功能分析与报告基因,选择标记基因,未经克隆的含TK基因的外源DNA使一些摄入细胞具有了在选择培养基上生存的能力，这样的基因称为选择性标记基因,转染实验TK 胸苷激酶,核苷酸从头合成和补救途径：编码补救途径的酶的基因(Hprt,Tk)可以用作选择标记,共转化与选择标记,两个物理上不相连的基因通过共转染，共同整合到基因组中的现象这是由于发生了整合之前的DNA融合只要能同时转入一个选择标记基因，共转化现象就可以使任何外源DNA序列稳定转入哺乳动物细胞根据标记基因筛选方法，选择标记可以分为：内源性选择标记、显性选择标记、扩增选择标记,内源性选择标记,来自于动物细胞内的标记基因，大多数涉及与冗余内源核苷酸生物合成途径内源性选择标记的缺点：只能用于那些对应基因不具有功能的突变细胞。,显性选择标记,显性选择标记：往往来自于细菌(外源)，因此其所提供的表型对于细胞来说是全新的，可用于任何细胞。这些标记通常是细菌的抗药基因，因此阳性细胞可以在适当的药物浓度的培养基上进行筛选。,扩增选择标记,当动物细胞暴露在某种药物的有毒浓度中，少数个别细胞由于自发的、扩增性的抗药突变而存活，这样的DNA上的扩增性标记，称为扩增选择标记出现扩增选择性标记的细胞栽种群中是随机出现的，可进行高浓度抗药性的筛选侧翼DNA序列可随标记基因一起扩增,氨基蝶呤,DHFR,叶酸,扩增选择标记,扩增选择标记也常可用于内源或显性选择标记，但常常用于扩增选择的药物不同,扩增选择标记常用于外源基因的高效表达,复制子载体：带有病毒复制子的载体,病毒基因组具有在宿主细胞内独立复制的能力可能造成溶解性感染，使宿主细胞裂解，如SV40，由于宿主细胞的裂解，实现的是一种高水平瞬时表达可能造成潜伏性感染，从而并不影响宿主细胞生长，实现稳定转染，如EBV和PBV，其中EBV载体相对于PBV载体复制更加稳定,SV40（猴多瘤病毒DNA）,病毒转导载体,外源DNA分子包入病毒粒子(通过连接或同源重组的方式插入病毒载体），后者吸附到细胞表面从而进入细胞效率很高，而且具有高效复制与高水平表达基因的潜能不仅可用于培养细胞，也可用于活体细胞腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、Lentivirus等,可复制病毒载体与复制缺陷型病毒载体,当转移基因插入到基因组中或它所替换的基因对于在宿主细胞中的感染周期不是必需时，载体可以独立的增殖，称为可复制的或不依赖辅助病毒载体。当转入基因替换了病毒的必需基因时，这样的载体则称为复制缺陷型或辅助病毒依赖性载体。因为它们失去的功能需要通过共转入携带有载体所缺失基因的辅助病毒来提供。,可复制病毒载体与复制缺陷型病毒载体:以杆状病毒为例,无内含载体,不具有所有病毒编码序列的载体，只含有包装和基因组扩增所必需的顺式作用元件。优点:1)可容纳高容量的外源DNA 2)不产生病毒基因产物，对细胞无毒性,第三节 细胞与应用,正常动物细胞生长特性,宿主动物细胞所需特性,正常细胞生长特性和宿主细胞所需特性上的差异某种程度上造成了各种表达系统对宿主细胞选择和应用的差异,第四节 动物基因操作,动物基因工程,动物基因工程,动物基因工程,动物细胞基因工程,转基因动物个体,动物工程细胞,动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型人体基因治疗,蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型,动物基因工程,哺乳动物 转基因小鼠 胚胎干细胞 同源重组 基因寻靶 克隆羊 核移植其他脊椎动物 爪蟾无脊椎动物 果蝇,产生转基因哺乳动物的方法,体细胞-卵细胞核替换显微注射受精卵反病毒侵染胚胎干细胞或早期胚,转基因小鼠,大多数动物细胞在发育能力上受到限制，不能产生转基因动物：分化的细胞无法完全去分化和重复发育动物中实现生殖细胞系转化的唯一途径就是在形成生殖细胞系的发育阶段之前把DNA导入全能细胞胚胎干细胞(Es Cells)是这样一个动物体特殊的全能细胞,转基因小鼠中的DNA转移方法,直接显微注射：注入刚受精卵细胞的雄或雌性原核中重组反转录病毒：不适宜产生完全的转基因动物，可用于形成胚转基因部分Es细胞转染：可利用标准标记进行筛选,胚胎干细胞(Es Cells),取自生殖细胞发育前的早期胚具有发育成动物的所有组织的能力受同源重组影响显著，可以用于基因寻靶，即可用外源DNA的同源片段精确地替换内源基因组的片段。,Es细胞的基因寻靶,外源DNA的同源片段精确替换内源基因组片段的过程由于同源重组的几率远低于随机整合，进行寻靶的细胞需要有较高的同源重组能力体外操作的多能性、可操作性以及同源重组的能力使Es细胞成为唯一适合于产生定向突变小鼠的细胞，即在每个细胞中携带有相同突变并能将其传递给生殖细胞系的小鼠。标记基因已被运用到寻靶过程和其后的筛选,寻靶载体,特化的质粒载体，导入到Es细胞后可以促进同源重组促进同源重组的原因主要是含有一段同源区转染前载体的线性化，有助于重组效率的提高多数基因寻靶是为了打断内源基因位点，使之无效，称为基因敲除,两种类型的寻靶载体：替代与插入,插入载体是打断了原基因，也会出现选择标记附近的序列重复，可能会导致再次的同源重组而回复野生型替换载体更普及,筛选策略,标记基因筛选：对于插入载体，标记基因可位于载体骨架内任何地方；对于替换载体，标记基因必须在同源区内。目前最常用的标记基因是neo标记。Southern blotPCRWestern blot,
