生物化学考前辅导班.ppt

,生物化学考前辅导,生命科学系杨卫民,content,一、各类学校题型与分值,卷 面 分 析,填空：20 30空，10 15分；,选择：10 15题，1015分；,名词：510个，1020分简答题：5 8个，2040分；,计算：1 2题，10 15分；,问答题：40 50分；,机会题比例很低！,content,二、反复考察的知识点,样 卷 分 析,酶活计算,DNA复制、RNA转录、蛋白质的生物合成,生物氧化,代谢调节：酶活、酶量（操纵子）；激素,糖、脂、蛋白、核酸代谢,名词解释：化学渗透学说,是目前最有说服力的解释氧化磷酸化作用机理的学说，电子传递释放出的自由能驱动H从线粒体基质跨过内膜进入到膜间隙（膜外），从而形成跨线粒体内膜外高内低的H电化学梯度。当H通过FOF1-ATP合酶回流进入线粒体基质时生成ATP,2.化学渗透学说,关于光合磷酸化的机理有多种学说，如中间产物学说、变构学说、化学渗透学说等，其中被广泛接受的是化学渗透学说。化学渗透学说(chemiosmotic theory)由英国的米切尔(Mitchell1961)提出，该学说假设能量转换和偶联机构具有以下特点：由磷脂和蛋白多肽构成的膜对离子和质子的透过具有选择性 具有氧化还原电位的电子传递体不匀称地嵌合在膜 膜上有偶联电子传递的质子转移系统 膜上有转移质子的ATP酶 在解释光合磷酸化机理时，该学说强调：光合电子传递链的电子传递会伴随膜内外两侧产生质子动力(proton motive force,pmf)，并由质子动力推动的合成。许多实验都证实了这一学说的正确性。,问答：以原核生物为例，阐述蛋白质的生物合成过程。（10）,答：蛋白质的合成亦称翻译，可分为四个阶段：1.氨基酸的活化氨酰tRNA（2）2.大肠杆菌中肽链合成的起始（3）mRNA上的SD序列可与小亚基上16SrRNA的3进行碱基配对，在起始因子的参与下先形成30S起始复合物，再形成70S起始复合物（70S-mRNA-fMettRNAfMet）。3.多肽链的延长（3）在多肽链上每增加一个氨基酸都需要经过进位，转肽和移位三个步骤。重复进位、转肽、移位，肽链沿NC方向延伸。4.翻译的终止及肽链的释放（2）锦上添花：新生肽链的折叠与后加工,蛋白质合成的机理,一、氨基酸的活化,二、原核生物多肽链的合成过程,四、真核生物多肽链的合成,三、多核糖体与核糖体循环,氨基酸的活化,E,氨基酸,ATP+,氨酰腺苷酸,E-AMP,PPi,第一步,AMP,第二步,E,氨基酸的活化,3-氨酰-tRNA,N-甲酰甲硫氨酰-tRNAiMet的形成,Met-tRNAiMet,fMet-tRNAtMet,N10-CHO-FH4,FH4,转甲酰酶,氨酰-tRNA合成酶特点,a、专一性：对氨基酸有极高的专一性，每种氨基酸都有专一的酶，只作用于L-氨基酸，不作用于D-氨基酸。对tRNA 具有极高专一性。,b、校对作用：氨酰-tRNA合成酶的水解 部位可以水解错误活化的氨基酸。,原核生物多肽链的合成过程,原核生物多肽链的合成分为三个阶段：肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止和释放。,1、肽链合成的起始,2、肽链的延长,3、肽链合成的终止及释放,肽链合成的起始,30S亚基 mRNA IF3-IF1复合物,30S mRNA GTP-fMet tRNA-IF2-IF1复合物,70S起始复合物,mRNA+30S亚基-IF3,IF-1,70S起始复合物,某些原核生物mRNA中蛋白质合成起始区的序列,肽链的延长,进位,肽键形成,移位,进位,(TuTs),肽键形成,3,（EF-G）,肽链合成的终止及释放,（1）释放因子RF1或RF2进入核糖体A位。（2）多肽链的释放（3）70S核糖体解离,RF,肽键的形成,TuTs循环,Ts,Ts-GDP,多多核糖体与核糖体循环,合成完毕的肽链,核糖体循环,多细胞水平,分子水平,细胞水平,神经系统调节,激素调节,酶调节,蛋白质,脂,水,糖,核酸,无机盐等,主要知识点回顾,前 言,酶和辅酶 生物氧化 糖化学及糖代谢 脂化学及脂代谢、生物膜 核酸及核酸代谢 蛋白质及蛋白质代谢 物质代谢调节及激素的作用机制,主要知识点回顾,目 录,主要知识点回顾,一、酶与辅酶,酶的本质、催化特点、分类 核酶、抗体酶、固定化酶、别构酶,酶的组成、活性中心概念,酶作用专一性假说诱导契合学说,酶反应动力学 米氏方程、转换数（Kcat）、酶活,抗体酶80年代后期出现的，本质是免疫球蛋白。在易变区被赋予了酶催化性。,核酶是非蛋白酶。它是一类特殊的RNA。能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。,当酶被底物饱和时，每一催化中心在单位时间内所能转换底物分子的数量，即每摩尔酶活性中心在单位时间内转换底物的摩尔数（/S）。分子活性,寡聚蛋白（多个亚基）,1IU：在最适条件下，每分钟内催化1mol产物生成所需的酶量。比活性（U/mg蛋白质）,酶活力计算题,10ml唾液，稀释20倍，取1ml测定淀粉酶活力，测知每5min水解淀粉产生2.5g还原糖,测定其稀释液中蛋白质含量为1mg/ml,计算唾液中淀粉酶的总活力，比活力，转换数(S-1)。酶活定义：在最适条件下每分钟水解淀粉生成1g葡萄糖的酶量称为1个活力单位。葡萄糖分子量180,淀粉酶分子量50000。,总活力=200 2.5/5=100 U比活力=2.5/51=0.5 U/mg转换数=(2.5/560180)/(1/5104+3)=12.5107/54000=2314.8(S-1),主要知识点回顾,一、酶与辅酶,酶的作用机制 理解酸碱催化、共价催化等（P391）,酶的抑制作用 三种可逆抑制剂,影响酶反应的因素 温度、pH、激活剂,高级结构,活性中心解离,EDTA半胱氨酸金属离子,酶促反应动力学,酶促反应动力学(kinetics of enzyme-catalyzed reactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。这些因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。注意：速度指反应的初速度V0；研究某一因素对酶促反应速度的影响时，应该维持反应中其它因素不变。,1）.米氏方程,Km 即为米氏常数，Vmax为最大反应速度,当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=S 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。Km值小，1/Km大，亲和力大。,底物浓度对酶促反应速度的影响,双倒数作图法,酶的抑制(机制),Competitive,Non-competitive,Uncompetitive,E,E,另一结合区,抑制剂,底物,图解,抑制机理及說明,I 只与自由的 E 結合，会与 S 竞争；S可克服 I 的抑制。,I 可与自由的 E 或 ES 結合，S不能克服 I 的抑制。,I 只能与 ES 結合，S反而有利 I 的抑制。,X,Vmax 不变；Km 变大,Vmax 变小；Km 不变,Vmax 及 Km 均变小,酶的活性部位,与酶的活性直接相关的区域为酶的活性中心。是酶与底物结合并发挥其催化作用的部位。结合酶的辅助因子是活性中心的重要组成部分。活性中心的氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同肽链，通过折叠后而在空间结构上相互靠近。,酶活性的调节控制,一）别构调节通过酶构象的改变来调节酶活性的作用称为变构调节。大部分别构酶的动力学曲线不符合米氏方程。,给酶共价结合一个基团或者去掉一个基团，从而改变其活性的调节方式。常见磷酸化。糖原磷酸化酶a 糖原磷酸化酶b,二）共价调节,Active relaxed form,Inactive tense form,主要知识点回顾,一、酶与辅酶,酶的调节作用 酶活调节：酶原激活、可逆的共价修饰、别构调节 酶量调节转录水平进行,辅酶 水溶性维生素的活性形式及功能P434,核酶：具有催化活性的RNA。非蛋白酶，识别特定RNA片段，进行内切，具有内切，连接，聚合等核酸酶功能。如：原生动物四膜虫26SRNA的内含子L19 RNA可自行催化（no protein）。核酸酶：即核酸水解酶，化学本质为蛋白质，催化核酸的水解。,核酶（ribozyme)和核酸酶,主要知识点回顾,二、生物氧化（氧化磷酸化）,1、概念、特点 P114,2、高能磷酸化合物类型,磷氧键型化合物 3-磷酸甘油酸磷酸、乙酰磷酸、ATP、磷酸烯醇式丙酮酸、氮磷键型化合物 磷酸肌酸、磷酸精氨酸硫酯键型化合物 酰基辅酶A甲硫键型化合物 S-腺苷甲硫氨酸,核苷酸衍生物,主要知识点回顾,3、脱氢酶的辅酶：NAD+、NADP+、FAD、FMN,NAD+,NADP+,核苷酸衍生物,主要知识点回顾,二、生物氧化（氧化磷酸化）,4、电子传递链成员、排列顺序、抑制剂,NADH-Q 还原酶,琥珀酸-Q 还原酶,细胞色素还原酶,细胞色素氧化酶,主要知识点回顾,二、生物氧化（氧化磷酸化）,5、氧化磷酸化作用机制（化学渗透学说）、P/O、解偶联剂（DNP作用机制）,6、氧化磷酸化的调控 能荷,7、底物水平磷酸化,主要知识点回顾,三、糖化学及糖代谢,1、糖的概念、分类,2、重要的单糖及衍生物 单糖磷酸酯、糖苷（0-糖苷键、N-糖苷键）、氨基糖,3、单糖的物理性质 变旋现象,5、常见二糖 单糖单位、糖苷键类型 还原糖鉴定,4、单糖的化学性质 成脎、成苷、颜色反应,糖原合成,糖代谢,糖异生,主要知识点回顾,TCA循环,丙酮酸氧化脱羧,糖原分解,激酶：能够在ATP和任何一种底物之间起催化作用，转移磷酸基团的一类酶。,磷酸酶：水解磷酸基团的酶。,生理意义,（肝脏中6-P-G磷酸酶、肌肉中Cori循环）,（6-P-G脱氢酶）,（6-P-G）,NADPH+H+，磷酸戊糖,异构化,基团转移,供能,（糖原合酶、糖原分支酶、UDP-G焦磷酸化酶）,（糖原磷酸化酶、糖原转移/脱支酶、磷酸葡萄糖变位酶）,有氧,（丙酮酸脱氢酶系/TPP）,3NADH+H+、FADH2、GTP,NADH+H+,2ATP,糖酵解,第一阶段,第二阶段,耗能,产能,NADH+H+,酶促化学修饰对酶活性的调节,主要知识点回顾,四、脂化学（生物膜）及脂代谢,1、脂质的概念、分类及作用（贮存、结构、活性脂质）（脂质体 P81）,2、脂肪酸种类、理化性质 熔点（与烷烃链长度成正比，与不饱和程度成反比）、溶解度、成脂酰CoA、乳化作用,3、三酰甘油的理化性质 皂化、酸值、碘值,7、脂蛋白结构特点及功能,5、萜（VA、VD、VE、VK，异戊二烯）和类固醇（类固醇激素，环戊烷多氢菲）,6、胆固醇、胆汁酸,4、磷脂 甘油磷脂、鞘磷脂母体化合物结构式 典型化合物:脑磷脂、卵磷脂的结构组成,？,主要知识点回顾,四、生物膜,1、结构特点（流体镶嵌模型）、膜脂组成,影响磷脂流动性的因素：所含的FA不饱和程度、链长，胆固醇、鞘磷酯的含量，膜蛋白及温度，pH等等。,主要特征：膜中的磷脂疏水尾相对，极性头朝外，基本结构是磷脂双分子层，有一定的流动性。蛋白质分子有的镶嵌在膜脂中，有的贯穿磷脂双层，膜Pr可侧向运动，围绕与膜平面垂直的轴旋转，但不能翻滚。膜Pr与膜脂，膜Pr与膜Pr等的相互作用限制了膜的流动性。膜在化学组成及结构上的不对称性，保证了膜功能（物质运输，信息传递）的方向性。糖类多以糖蛋白，糖脂的形成结合在细胞表面天线，在接受信息与细胞识别上起重要作用。,膜结构液态镶嵌模型（1972，）,液态镶嵌模型（液晶态镶嵌模型）膜是蛋白质在粘滞的流体状脂质双层中所形成的镶嵌物。,侧向扩散/移动、翻转、全反式偏转异构化运动、围绕与膜平面垂直的轴摆动、旋转,主要知识点回顾,四、生物膜,2、生物膜的主要功能 能量转换、物质运输、信息识别与传递,主动运输 Na+,K+-ATP酶（泵）下P47,被动运输,糖和氨基酸的运送,磷酸烯醇式丙酮酸转磷酸化酶系统（PTS）,协同运输,基团转运,酮体的合成,脂代谢,脂肪酸的合成,主要知识点回顾,（软）脂肪酸的氧化129ATP活化（胞浆），转运（肉碱脂酰转移酶），-氧化（线粒体）,甘油代谢,脂肪动员,胆固醇的合成,乙酰CoA,TCA,羟甲基戊二酸单酰CoA（HMG-CoA）,酮体肝内生成，肝外利用（硫解/激酶）,胆固醇代谢：胆汁酸、激素、VD3,储能,（胆盐乳化、脂蛋白运输）,乙酰乙酸、-羟丁酸、丙酮,HMG-CoA裂解酶,HMG-CoA还原酶,甘油三酯脂肪酶,柠檬酸-丙酮酸穿梭至胞浆,乙酰辅酶A羧化酶,3-磷酸甘油磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油酸EMP,单位碳原子产能效率高,主要知识点回顾,五、核酸及核酸代谢,1、核酸定义,2、分类 DNA RNA（紫外吸收）,一级结构,二级结构 双螺旋 tRNA mRNA rRNA,PCR（变性、复性、杂交）增色、减色效应,三级结构,高级结构（蛋白复合物）,3、分离、提纯、定量 理解,4、核苷酸序列测定 理解,PCR（聚合酶链式 反应）,即聚合酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction)，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。PCR技术的基本原理：PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：加热至93左右，模板DNA双链解离，成为单链；单链DNA与引物的退火(复性)：温度降至55左右，特异性的引物与模板DNA单链的3末端结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，合成一条新链；这种新链又可成为下次循环的模板，重复变性-退火-延伸三过程，就可获得更多DNA。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将目的基因扩增放大几百万倍。,PCR技术的发展与应用：P596,DNase I足迹试验,蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。DNase I足迹试验的实验流程如下：待检双链DNA分子用32P作末端标记，通常只标记一端；蛋白质与DNA混合，等两者结合后，加入适量的DNase I，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，并列设置未加蛋白质的对照；从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。,嘌呤元素来源嘧啶元素来源,核酸代谢,嘌呤核苷酸合成,主要知识点回顾,碱基降解,核蛋白经胃酸、核酸酶、核苷酸酶、核苷磷酸化酶成磷酸戊糖和碱基,嘧啶核苷酸合成,NH3+CO2+H2O,（黄嘌呤氧化酶）痛风 别嘌呤醇,嘧啶,嘌呤,尿酸,从头合成、补救途径PRPP,脱氧核糖核苷酸合成,P399 图33-11,DNA复制、RNA生物合成,主要知识点回顾,5、DNA复制,起始-延伸-终止,结果:半保留,端粒、端粒酶（真核生物）,（酶、辅助因子、全过程）,DNA聚合酶III,过程:半不连续,冈崎片段,复制叉移动方向,单链结合蛋白,RNA引物,DNA连接酶,DNA拓扑异构酶,DNA解旋酶,引物酶,引发体,DNA聚合酶I,复制叉,主要知识点回顾,6、RNA生物合成,起始-延伸-终止,转录泡,识别部位 结合部位 RNA转录开始+1（GTP，ATP),（酶、辅助因子、全过程）,逆转录酶,逆转录酶是一种多功能酶,以RNA为模板合成互补的DNA链，形成RNADNA的杂合分子。具有Rnase H样的活力，水解RNADNA的杂合分子中的RNA。以新合成的单链DNA为模板，合成互补链，形成双链DNA分子。,主要知识点回顾,6、RNA生物合成,转录产物的加工,去除内含子加帽又加尾,甲基化3-CCA-OH,甲基化修饰,剪接、甲基化修饰,多数不用加工,7、原核细胞基因表达的模型操纵子学说,主要知识点回顾,组成：启动子、操纵基因、结构基因,组成酶诱导酶,葡萄糖分解代谢产物抑制腺苷酸环化酶活性，cAMP减少，分解代谢酶转录水平低。,启动子,操纵基因,结构基因,启动基因，转录调控的控制部位，RNA聚合酶的结合部位，是基因转录的起点。,主要知识点回顾,原核细胞基因表达的模型操纵子学说,衰减子：一种位于结构基因上游前导区的终止子。,转录是否进行,转录是否继续,主要知识点回顾,六、蛋白质及蛋白质降解、氨基酸分解,1、蛋白质的基本单位AA-氨基酸结构式,酸碱化学（AAo、PI）,光学性质,AA的分离 分配层析 离子交换层析,化学反应,AA分类（R基极性特点）,茚三酮显色、Sanger反应、Edman反应,主要知识点回顾,六、蛋白质及蛋白质降解、氨基酸分解,2、蛋白质的四级结构,一级结构：AA的排列顺序 肽键 一级结构测定,二级结构：借助氢键形成的规则结构 四种,三级结构：疏水作用 空间折叠 分子伴侣 功能单位,四级结构：疏水作用 亚基间相互作用 别构酶,X射线衍射法,结构与功能的关系（肌红蛋白、血红蛋白）,蛋白质的变性本质：蛋白质分子中的次级键被破坏，引起天然构象解体。现象：生物活性丧失，一些侧链基团暴露，溶解度降低形成沉淀，分子结构松散，易被蛋白水解酶分解。变性剂：尿素、盐酸胍、SDS,超二级结构（基元或膜体）：、P220,结构域：功能域，三级结构的局部折叠区，相对独立的紧密球实体。P222,球状蛋白折叠层次,主要知识点回顾,六、蛋白质及蛋白质降解、氨基酸分解,3、蛋白质的分离、纯化、表征,蛋白质的酸碱性质,纯化方法,分子大小,溶解度,电荷,选择性吸附,亲和层析,疏水层析,蛋白质表面疏水性差别,生物学亲和力,理解P315表7-7,电泳纯,含量测定方法：凯氏定氮（16%）、双缩脲法（肽键）、考马斯亮蓝法,主要知识点回顾,六、蛋白质降解、氨基酸分解,4、蛋白质的降解,内源性蛋白降解机制：溶酶体、泛肽标记,外源性蛋白消化：,胰蛋白酶：碱性氨基酸糜蛋白酶：芳香族氨基酸（胰凝乳蛋白酶）羧肽酶：羧基末端肽（小肽）氨肽酶：氨基末端肽（小肽）,外源性AA吸收：,依赖于Na+的主动运输-谷氨酸酰基循环（GSH）,主要知识点回顾,转氨基作用氧化脱氨（L-谷氨酸脱氢酶）联合脱氨（转氨酶与L谷氨酸脱氢酶联合脱氨、腺嘌呤核苷酸循环联合脱氨）,氨的运输：肌肉内葡萄糖-丙氨酸循环（谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶）谷氨酰胺,关键酶：氨甲酰磷酸合成酶与TCA的联系：精氨琥珀酸AA种类：瓜、精、鸟、天冬氨酸等,维生素作为辅酶的作用,一碳单位 FH4，S-腺苷甲硫氨酸,5、AA的分解,蛋白质的生物合成（原核生物）,主要知识点回顾,AA的活化与搬运氨基酰tRNA的合成 肽链合成的起始起始复合物的形成 四个阶段（70S-mRNA-fMet-tRNA）肽链的延伸包括进位,转肽,移位.肽键的终止终止codon,信号肽结构及功能,RNA种类及作用蛋白质,分子伴侣,蛋白质的后加工（一级、高级）,主要知识点回顾,七、物质代谢调节和激素的作用机制,1、P540图39-1 四大物质代谢相互关系示意图 乙酰辅酶A的来源与去路,2、P543图39-5 主要产能营养物分解代谢的三个步骤,细胞浆：EMP HMS 脂肪酸合成线粒体：TCA 氧化 氧化磷酸化细胞核：核酸生物合成内质网：蛋白生物合成溶酶体：水解酶,主要知识点回顾,七、激素的作用机制,激素由细胞分泌出来，由体液运往各靶器官和靶细胞起作用。高等动物的激素分三类；含氮类激素、类固醇激素、脂肪酸衍生物激素。作用机制：含氮类激素的作用机制第二信使学说 类固醇激素的作用机制调节基因表达,一、膜受体cAMP作用途径,二、钙及肌醇三磷酸作用途径,主要知识点回顾,七、激素的作用机制,三、受体酪氨酸酶途径,主要知识点回顾,八、基因工程和蛋白质工程,P614-615 提要,基因工程与蛋白质工程,基因工程是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。蛋白质工程是指对蛋白质已知结构与功能的认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术改造蛋白质。基因重组是指分子间或分子内发生遗传信息的重新组合，也称为遗传重组（genetic recombination)或基因重排（gene rearrangement)。重组产物称重组DNA(recombinant DNA)。,黏末端（sticky）和平末端(blunt),黏末端末端突出的限制性内切酶酶解反应的产物可以通过单链尾部的碱基配对，与其他任何具有相同突出序列的末端结合，在连接酶的作用下共价连接在一起平末端末端不突出的限制性内切酶酶解片段,基因工程技术上的三大发现：限制性核酸内切酶的发现 DNA连接酶的发现 基因工程载体的发现,科学家有了对DNA切割与连接的工具(酶)，还不能完成DNA体外重组的工作。因为大多数DNA片段不具备自我复制的能力。所以，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，必须将DNA片段连接到一种具有自我复制的DNA分子上。这种DNA分子就是基因工程载体(Vector)。,重组体向宿主细胞的导入,基因的扩增(amplification)带有外源DNA片段的重组体分子在体外构成之后，需要导入适当的寄主细胞进行繁殖，才能够获得大量的纯一的重组体DNA分子。注意：选定的寄主细胞必须具备使外源DNA进行复制的能力，而且还应该能够表达由导入的重组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利于转化子细胞的选择与鉴定。,质粒载体,质粒的正常复制依赖于宿主细胞中的聚合酶及其他组分，但其本身含有复制起点用以保证质粒的自主复制质粒为染色体外的小型环状DNA分子,大小约为2200kb，通常以多拷贝形式存在与大肠杆菌（宿主）中,Inserting a DNA Sample into a Plasmid,大肠杆菌质粒分子结构,外源质粒导入宿主细胞,目的基因与载体的连接,限制性核酸 内切酶 DNA分子体外重组技术 DNA连接酶,Thank you!,