生物化学简明教程第二章蛋白质.ppt

第二章 蛋白质,蛋白质主要元素组成：C、H、O、N、S 及 P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se 等微量元素。,蛋白质平均含N量为16,这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据：蛋白质含量蛋白质含N量6.25,第一节 蛋白质的分类,一、根据分子形状分类,二、根据分子组成分类,单纯蛋白质（如清蛋白等）结合蛋白质（如核蛋白等）,三、根据功能分类,催化蛋白调节蛋白结构蛋白运输蛋白贮藏蛋白运动蛋白防御蛋白 电子传递蛋白,第二节 蛋白质的组成单位-氨基酸,一、氨基酸的结构,1、结构通式,C,COOH,H,NH2,R,2、构型：L型、D型,二、氨基酸的分类,1、按R基的极性不同来分类,非极性R基氨基酸,含脂肪烃R基：Gly、Val、Ala Leu、Ile、,含芳香环及杂环R基：Phe、Trp、Pro,极性R基氨基酸,不带电荷的极性R基：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys,带正电荷的极性R基：Lys、His、Arg,带负电荷的极性R基：Asp、Glu,2、按R基的化学结构不同来分类,脂肪族氨基酸,含一氨基一羧基的中性氨基酸：,Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Cys、Met,含羟基的氨基酸：,Ser、Thr、,含酰基的氨基酸：,Asn、Gln,含一氨基二羧基的酸性氨基酸：,含二氨基一羧基的碱性氨基酸：,Asp、Glu,Lys、Arg,芳香族氨基酸：,杂环族氨基酸：,Phe、Tyr,Trp、His、Pro,三、氨基酸的理化性质,1、一般物理性质,2、化学性质,（1）氨基参加的反应,与亚硝酸的反应,与甲醛的反应,与2，4-二硝基氟苯的反应,与异硫氰酸苯酯的反应,（2）羧基参加的反应,成盐和成脂反应,脱羧反应,（3）氨基和羧基共同参加的反应,两性解离（两性离子、两性解离、等电点）,茚三酮反应,成肽反应,（4）由侧链基团参加的反应,双缩尿反应,黄蛋白反应,乙醛酸反应,坂口反应,酚试剂反应,米伦氏反应,第三节 肽,一、肽的结构,几个重要的概念：肽、肽键、氨基酸 残基、N端C端、多肽、二硫键、酰氨平面,第四节 蛋白质的结构,（一）、蛋白质的一级结构,（二）、空间结构包含的内容,1、蛋白质的二级结构,（1）、定义,定义,举例：胰岛素的一级结构,（2）、包含内容,-螺旋结构,-折叠结构,-转角结构,（3）、超二级结构：,、曲折,（4）、结构域,2、蛋白质的三级结构,举例：鲸肌红蛋白的三级结构,3、蛋白质的四级结构,举例：血红蛋白的四级结构（亚基）,三、维持蛋白质构象的化学键,1、共价键：肽键、二硫键,2、非共价键：氢键、范德华力、盐键（离子键）、疏水键,第五节 蛋白质结构与功能的关系,一、蛋白质一级结构和功能的关系,1、种属差异,2、分子病,二、蛋白质的空间结构与功能的关系,*别构现象,第六节 蛋白质的性质与分离、分析技术,一、蛋白质的性质,1、蛋白质的相对分子质量 沉降系数S,2、蛋白质的两性解离和等电点 等电点isoelectric point：蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等时溶液的pH值。pI在有中性盐时有明显变化，因分子中某些解离基团可与盐的离子如Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO42-结合，观察到的pI在一定程度上决定于介质中离子的组成。pI是蛋白质的一个特征常数。,不同的蛋白质有不同的等电点 等电点是蛋白质的一个特征常数，其等电点是由可解离基团的种类和数目决定的，而这在不同的蛋白质中是不同的。不同蛋白质的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的多少，直接影响蛋白质等电点的大小。蛋白质在等电点时的溶解度最小，因此不同蛋白质的等电点不同来沉淀不同的蛋白质，分离蛋白质混合物。,3、蛋白质的变性,（1）、变性的概念 在变性因素作用下，天然蛋白质一级结构保持不变，高级结构发生了异常的变化，由天然态的折迭态变成了变性的伸展态，引起生物功能的丧失，理化性质的改变的现象。,氨基酸的甲醛滴定,*反应特点A.为-NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与-NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。*应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,Edman（苯异硫氰酸酯法）：由Edman于1950年首先提出，为-NH2的反应，用于N末端分析，又称Edman降解法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸分离PTH-氨基酸层析法鉴定Edman降解法的改进方法-DNS-Edman降解法用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸原理DNFB法相同但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍可用于微量氨基酸的定量,*反应特点A.为-NH2的反应B.氨基酸-NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸,与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应,*应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸C.分离DNP-氨基酸D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目,Corey&Pauling,特征：1、每隔3.6个AA残基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;2、螺旋体中所有氨基酸残基R侧链都伸向外侧，链中的全部C=0 和N-H几乎都平行于螺旋轴;3、每个氨基酸残基的N-H与前面第四个氨基酸残基的C=0形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。,螺旋（helix）,形成因素：与组成和排列顺序直接相关。多态性：多数为右手（较稳定），亦有少数左手螺旋存在（不稳定）；存在尺寸不同的螺旋。,*影响-螺旋形成的因素 氨基酸组成和序列？R基团？脯氨酸？,-折叠,定义：两条或几条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的氨基和羰基之间形成有规则的氢键，维持这种片层结构的稳定。,特点：多肽链主链比较伸展，相邻aa的轴心距为0.35nm，侧链R交 替分布在片层平面的上、下方。有平行和反平行两面种 几乎所有的肽键都参与了链间氢键的形成,肌红蛋白的三级结构,肌红蛋白（myoglobin）分子由一条多肽链（153个残基）和一个血红素组成。分子呈扁圆形，大小为4.5nm3.5nm2.5nm。多肽链主链骨架包含长短不等的A、B、C、D、E、F、G、H 共8个-螺旋。分子中几乎80的氨基酸残基都是位于-螺旋结构中。-螺旋之间的拐弯处（AB、CD、EF、FG、GH）是无规卷曲。绝大多数亲水性R侧链分布在分子的外表面，与水分子结合，使肌红蛋白可溶于水溶液中。绝大多数疏水性R侧链埋藏在分子内部。,分子表面有一个深陷的洞穴。该洞穴由C、E、F、G 共4个螺旋段构成。洞穴周围分布许多疏水性R侧链，从而为洞穴构成了疏水性环境。平面的血红素分子埋人疏水的洞穴中。维持肌红蛋白分子二级结构的力是范德华引力、疏水键、氢键和配位键。,血红蛋白的四级结构,维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键,a盐键（离子键）b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键,甘氨酸（Gly,G）,丙氨酸（Ala,A）,缬氨酸（Val,V）,亮氨酸（Lue,L）,异亮氨酸（Ile,I）,中性脂肪族氨基酸,含羟基或硫脂肪族氨基酸,丝氨酸（Ser,S）,苏氨酸（Thr,T）,半胱氨酸（Cys,C）,甲硫氨酸（Met,M）,酸性氨基酸及酰胺,天冬氨酸（Asp,D）,谷氨酸（Glu,E）,天冬酰胺（Asn,N）,谷氨酰胺（Gln,Q）,碱性氨基酸,赖氨酸（Lys,K）,精氨酸（Arg,R）,杂环氨基酸,组氨酸（His,H）,脯氨酸（Pro,P）,芳香族氨基酸,苯丙氨酸（Phe,F）,酪氨酸（Tyr,Y）,色氨酸（Trg,W）,氨基酸的兼性离子形式：氨基酸或肽在晶体或水中以兼性离子形式存在，熔点高。,为什么？,氨基酸的两性解离,pH=pI 净电荷=0,pH pI净电荷为正,pH pI净电荷为负,(pK1),(pK2),pH=pI：蛋白质处于中性环境，两边解离趋势相等而成兼性离子pH pI：蛋白质处于碱性环境，羧基解离趋势大于氨基而成负离子pH pI：蛋白质处于酸性环境，氨基解离趋势大于羧基而成正离子,氨基酸的等电点,当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelectric point，pI)。,*在氨基酸等电点以上任何pH，AA带净的负电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等电点以下任何pH，AA带净的正电荷，在电场中向阴极移动。*在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多。,氨基酸等电点的计算,可见，氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK值之和的二分之一。,蛋白质两性解离性质和等电点,当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）。,转角（-turn）,特征：多肽链中氨基酸残基n的羰基上的氧与残基（n+3）的氮原上的氢之间形成氢键，肽键回折1800。,五、蛋白质的超二级结构和结构域,(2)结构域（structure domain）,蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个螺旋或折叠或转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构基本组合方式：；,在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。形成意义：动力学上更为合理 蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性,()超二级结构（supersecondary structure）,卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域,-螺旋,-转角,-折叠,二硫键,结构域1,结构域2,a-氨基可与亚硝酸反应产生氮气,一级结构,四级结构,二级结构,三级结构,primary structure,secondary structure,Tertiary structure,quariernary structure,第四节 蛋白质的二级结构,氢键（hydrogen bond）主要维持蛋白质分子的二级结构，对三、四级结构亦有一定作用。范德华引力（Van der weals force）实质是静电引力，维持三、四级结构。包括：二个极性基团偶极之间的静电吸引（取向力）；极性基团的偶极与非极性基团的诱导偶极之间的静电吸引（诱导力）；二个非极性基团瞬时偶极之间的静电吸引（色散力）。,疏水作用力（hydrophobic bond）2个或2个以上的疏水基团（非极性基团）因极性水分子的排斥而接近，因范德华引力而结合，这种结合力称疏水作用力或疏水键。主要维持三、四级结构。离子键（ionic bond）正负离子之间的静电吸引产生的化学键。在一些蛋白质分子中，离子键参与维持三、四级结构。,。二硫键（disulfide bond）指二个硫原子之间的共价键，又称二硫桥、硫硫桥。在一些蛋白质中，二硫键对稳定蛋白质分子构象起重要的作用。,患者的Hb量仅为正常人（1516g/100m1）的一半，红细胞数目是正常人(4.66.2)106个/ml的一半左右，且形态不正常，除有大量的未成熟红细胞外，还有很多长而薄、新月状或镰刀状的红细胞。当红细胞脱氧时，这种镰刀状细胞明显增加。纯合子（50%红细胞镰刀状化）多在童年死去，无后代；杂合子患者（1的患者红细胞镰刀状化）的寿命也短，但能抵抗流行于非洲的致死性疟疾（malaria），会有后代。,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,镰刀形红细胞,正常红细胞,氨基酸序列的细微变化 正常的血红蛋白Hb和异常的血红蛋白HbS仅在链的第6个氨基酸有Glu变为了Val，电泳时向正极的移动速度HbS比HbA稍慢。,人类发现的300多种血红蛋白变体，绝大多数只有一个氨基酸差异，因为取代的位置不同，对功能的影响程度有差异，但目前对取代氨基酸影响功能的了解很少。,-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,镰刀状细胞血红蛋白的治疗性矫正 体外用氰酸钾处理患者的红细胞，可防止在去氧时形成镰刀状，输氧能力有好转。,蛋白质两性解离性质和等电点,当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）。,The thermal denaturation of ribonuclease,变性是一个协同过程：在很窄的变性剂浓度范围，很窄PH或温度。,（2）、引起蛋白质变性的因素有：.物理因素 热（60100）、紫外线、X射线、超声波、高压、表面张力，以及剧烈的振荡、研磨、搅拌等；.化学因素 化学因素又称为变性剂，包括：酸、碱、有机溶剂（如乙醇、丙酮等）、尿素、盐酸胍、重金属盐、三氯醋酸、苦味酸、磷钨酸以及去污剂等。,（3)、变性表现及变性机理.生物功能丧失；.物理性质发生改变；.化学性质发生改变；.侧链基团暴露,(4)、复性 复性：蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。如1条肽链、4个二硫键的RNA酶，被8mol/L尿素和巯基乙醇变性，二硫键全部断裂，酶活性和结晶能力全部丧失，若透析除去变性剂，在氧存在下二硫键重新生成，酶活性全部恢复，并恢复结晶能力，说明RNA酶由变性态恢复到天然态。,由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。,4、蛋白质的胶体性质,透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。,5、蛋白质的沉淀,如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。沉淀方法:盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（salting out）。,分段盐析沉淀反应：不同蛋白质分子的水膜厚度和带电量不同，发生盐析所需要的盐浓度不同。改变盐浓度可分离蛋白质混合物，这被称为分段盐析法。,.有机溶剂沉淀反应 降低溶液的介电常数，使蛋白质发生沉淀。改变有机溶剂的种类和浓度，可分离蛋白质混合物，这被称为有机溶剂分级法。,.重金属盐沉淀反应 在碱性溶液中，蛋白质分子的负离子基团（如-COO-）可以与重金属盐（如醋酸铅、氯化高汞、硫酸铜等）的正离子结合成难溶的蛋白质重金属盐，并从溶液中沉淀下来。在临床上，利用这种特性抢救重金盐中毒的病人和家畜。,.生物碱试剂沉淀反应 生物碱试剂（如苦味酸、单宁酸、三氯醋酸、钨酸等）在溶液pH小于蛋白质等电点时，其酸根负离子能与蛋白质分子上的正离子基团相结合，变成为溶解度很小的蛋白盐，并从溶液中沉淀下来。临床化验时，常用上述生物碱试剂除去血浆中干扰测定的蛋白质。,（一）、利用溶解度差别的纯化方法.等电点沉淀和pH控制 蛋白质是带有正电荷和负电荷基团的两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量则因pH不同而变化。蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。,二、蛋白质分离纯化方法,.蛋白质的盐溶和盐析盐溶salting in：在蛋白质水溶液中加少量中性盐，增加分子表面电荷，增强分子与水的作用，使蛋白质在水溶液中的溶解度增大的现象。,盐析salting out：在高浓度的盐中，离子将蛋白质水化膜的水夺去，使蛋白质发生沉淀的现象。如饱和硫酸铵。中性盐影响蛋白质溶解度的能力是离子强度的函数。离子强度（ionic strength）可以定义为：,ci为各离子的浓度，Zi为各离子的净电荷，表示求和。未解离的电解质和携带电荷相等的兼性离子不计入电荷的计算，它们不增强溶液的离子强度。,.有机溶剂分级分离法 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数（dielectric constant）。水是高介电常数物质（20时，80），有机溶剂是低介电常数物质（20时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4），因此有机溶剂的加人使水溶液的介电常数降低。,.温度对蛋白质溶解度的影响 在040之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但人的血红蛋白从025，溶解度随温度上升而降低。在4050以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，在中性pH介质中失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0或更低的温度下进行。,（二）、根据分子大小不同的纯化方法.透析和超过滤dialysis and ultrafiltration 透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜，使蛋白质和其他小分子物质分开的方法。半透膜：玻璃纸（cellophane paper，或称赛璐玢纸）、火棉纸（celloidin paper，又称赛璐碇纸）和其他改型的纤维素材料。,超过滤：透析时对半透膜加压，一般液体与膜表面相切的方向流动，使部分液体透过膜，另一部分液体切向流过膜表面，将膜截留的蛋白质分子冲走（反流回样品槽），避免在滤膜表面堆积塞。样品含量低时因吸附不能回收而采用此法。,蛋白质的超滤,.密度梯度（区带）离心density gradient(zone)centrifugation 蛋白质颗粒在有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降快，到与自身密度相等的介质密度梯度即停止，最后各种蛋白质在离心管（常用塑料管）中被分离成各自独立的区带，在管底小孔分部收集。常用蔗糖梯度，聚蔗糖梯度和其他合成材料。蔗糖便宜，纯度高，浓溶液（60，W/W）密度可达1.28g/cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，由蔗糖和1-氯-2,3-环氧丙烷合成的高聚物，Mr约400,000，需高密度和低渗透压的梯度时，可用Ficoll代替蔗糖。,.凝胶过滤gel filtration 又称凝胶过滤层析、分子排阻（molecular-exclusion）层析、凝胶渗透（gel permeation）层析。这是按大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。常用的凝胶有交联葡聚糖，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。交联葡聚糖是由线形的-1,6-葡聚糖与1-氯-2,3-环氧丙烷反应而成的化合物，商品名称为Sephadex。聚丙烯酰胺凝胶（商品名称为Bio-gel P）是一种人工合成的凝胶，它是由单体丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylamide）共聚而成的。琼脂糖是从琼脂中分离制得的，商品名称微为Sepharose或Bio-Gel A，这种凝胶的优点是孔径大，排阻极限高。,小分子进入凝胶分子内，被滞留,大分子在凝胶颗粒间移动，较快流出,溶剂流动方向,按分子量从大到小依次流出,凝胶过滤层析原理,（三）、根据电荷不同的纯化方法.电泳electrophoresis 电泳或离子泳ionphoresis：在电场作用下，带电颗粒向与其电性相反的电极移动的现象。,（2）.离子交换层析 用于各种两性分子混合物的分离，蛋白质和核酸大分子层析的支持介质一般是纤维素离子交换剂和交联葡聚糖离子交换剂。阳离子交换剂：CM-纤维素（弱酸型）；P-纤维素（中强酸型）；SE-纤维素（强酸型）；SP-Sephadex（强酸型）；阴离子交换剂：AE-纤维素（弱碱型）；PAB-纤维素（弱碱型）；DEAE-纤维素（中强碱型）；DEAE-Sephadex（中强碱型）；TEAE-纤维素（强碱型）；QAE-Sephadex（强碱型）；,（四）、利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 亲和层析affinity chromatography：利用蛋白质对其配体分子特有的识别能力，即生物学亲和力建立起来的分离纯化方法。最先用于酶的纯化，现广泛用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整的细胞的纯化。凝集素亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合层析（metal chelate chromatography）、染料配体层析和共价层析等都属于亲合层析类,抗体和抗原的结合：高度特异性,把抗体作为“鱼饵”（配体），分离抗原。,亲和层析的操作机理,固相载体,(1),(2),(3),Sample,Washing,Elution,三、蛋白质分子中氨基酸序列的测定,测定蛋白质的分子质量和多肽链的数目拆开蛋白质分子的多肽链断开多肽链内的二硫键分析每一条多肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的N末端和C末端残基把多肽链裂解成两组以上大小不等的较小片段测定各肽段的氨基酸序列重叠各肽段，重建完整多肽链的一级结构顺序确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置,.多肽链数目的测定 根据蛋白质N端和C端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可确定分子中的多肽链数目。若含一条多肽链，蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数相等；如果后者是前者的倍数，说明该蛋白质分子是由多条多肽链组成。如果检测到的末端基多于一种，表明蛋白质由两条或多条不同的多肽链组成，即样品是杂多聚蛋白质（heteromultimeric protein）。,.拆分蛋白质的多肽链 寡聚蛋白质的亚基必须拆分。可用变性剂如8 mol/L尿素、6 mol/L盐酸胍或高浓度盐处理。若亚基间通过二硫桥（S-S）交联，如胰岛素（含两条多肽链）和-胰凝乳蛋白酶（含3条多肽链）则可用氧化剂或还原剂将二硫键断开。拆开后的单个多肽链可根据它们的大小或/和电荷的不同进行分离、纯化。,由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,.拆开多肽链内的二硫桥 多肽链内半胱氨酸残基之间的S-S桥必须在进行第4步前予以断裂。,几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,.测定每一条多肽链的氨基酸组成 分离纯化的多肽链一部分样品完全水解，测定氨基酸组成，计算氨基酸成分的分子比或各种残基的数目。.鉴定多肽链的N端和C端残基 多肽链的另一部分样品进行末端残基的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸序列参考点。,*N端测定.二硝基氟苯（DNFB或FDNB，sanger试剂）法 DNFB与AA的-NH2的反应被广泛用于测定N-末端AA。多肽或蛋白质的游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-多肽或DNP-蛋白质对酸水解比肽键稳定，因此DNP-多肽经酸水解后，只有N-末端AA为黄色DNP-AA衍生物，其余的都是游离AA。鉴别DNP-AA，便可得知多肽链的N-末端残基。多肽侧链上的-NH2、酚OH等也与DNFB反应，但生成的侧链DNP衍生物，如-DNP赖氨酸当用有机溶剂（如乙酸乙酯）抽提时将与游离氨基酸一起留在水相，因而容易和-DNP氨基酸区分开来。待分析的DNP-氨基酸可用纸层析、薄层层析或HPLC进行分离鉴定和定量测定。,.丹磺酰氯（dansylchloride，DNS）法 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的简称，原理与DNFB法相同。丹磺酰基有强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，且水解后的DNS-AA不需提取，可直接用纸电泳或薄层层析加以鉴定。.苯异硫氰酸酯（PITC，Edman试剂）法 多肽和蛋白质的末端氨基和AA的-NH2能与PITC作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，称PTC-多肽或蛋白质，它在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC-AA环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上脱下，除去N端AA的肽链仍然完整。代表N端残基的PTH-AA经有机溶剂抽提干燥后，可用薄层层析（如硅胶薄膜或聚酰胺薄膜）、气相色谱和HPLC鉴定。,.氨肽酶（amino peptidase）法 氨肽酶是一类肽链外切酶（exopeptedase）或称为外肽酶，从多肽链的N端逐个向内切，根据反应时间的不同测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，作出反应时间与残基释放的动力学曲线，来推测蛋白质的N端氨基酸序列。但困难在于酶对各种肽键的敏感程度不一样，常常难于判断哪个残基在前，哪个残基在后。亮氨酸氨肽酶（leucine amino peptidase,shorted by LAP）对以亮氨酸的氨基形成的肽键的水解速度最快，对其它肽键的水解速度则较慢。当谷氨酸环化而形成焦谷氨酸氨使N端被封闭时，使用焦谷氨酸氨肽酶（pyroglutamate aminopeptidase）则可专一性地水解焦谷氨酸氨NH2形成的肽键。,*C端测定.肼解（hydrazinolysis）法 C端测定的重要方法。蛋白质或多肽与无水的肼加热时发生肼解，C端AA以游离形式存在，其它氨基酸都形成相应的氨基酰肼化物，它与苯甲醛作用形成不溶于水的二苯基衍生物，游离的C端AA以FDNB和DNS鉴定。谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸被破坏不易测定，C端的精氨酸转变为鸟氨酸。,.还原法 肽链C-末端AA可用硼氢化锂还原为-氨基醇，肽链完全水解后，代表原来C端AA的-氨基醇可用层析加以鉴别。,.羧肽酶（carboxypeptidase）法 有效和常用。专一性从C端逐个水解出游离AA，被释放的AA数目与种类随反应时间而变化，由此推测C端氨基酸序列。几个氨基酸释放速度相近或两个相同氨基酸毗邻时，小心结果。,.裂解多肽链成较小的片段 用两种或几种不同的断裂方法（指断裂点不一样）将每条多肽链样品降解成两套或几套重叠的肽段或称肽碎片。每套肽段进行分离、纯化，并对每一纯化了的肽段进行氨基酸组成和末端残基的分析。,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,.测定各肽断的氨基酸序列 最常用Edman降解法，并有自动序列分析仪可供利用，此外尚有酶解法和质谱法等。,.建立完整多肽链的一级结构 利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间有交错重叠可以拼凑出原来的完整多肽链的氨基酸序列。.确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥的位置 氨基酸序列测定中不包括辅基成分分析，但是它应属于蛋白质化学结构内容。一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,