液相色谱法测定茶叶中黄曲霉毒素B.ppt
,陈玉森学号：03088009,液相色谱法测定茶叶中黄曲霉毒素B1,1、黄曲霉毒素，aflatoxin,简写AFT。一、概述 为黄曲霉产毒菌株的代谢产物，属超剧毒物质。尤以AFTB 1 最为重要，毒性最强。,2、理化性质,（1）溶解性：难溶于水和乙醚、石油醚、已烷等非极性或弱极性溶剂中。易溶于甲醇、氯仿、乙腈等极性溶剂中，溶于苯。（2）定性：对光、热、酸稳定；对碱和氧化剂不稳定。光：AFTB 1 和AFTG 1 溶液，日光照1d，分解仅40%。得低浓度纯品易为紫外光破坏。故标准品宜用黑纸包裹储存。热：开始分解温度 B 1，268269 酸：弱酸和中性介质中稳定；强酸和碱性条件下分解。pH?时分解；pH=910时迅速分解成几乎无毒的盐（内酯键打开）：氧化剂：对氧化剂也不稳定，氧化剂浓度越大，分解速度越快：,C NaClO(g/L)破坏AFT所需的时间,54.5(g/L)立即 50(g/L)5s 40(g/L)1min 30(g/L)2min 20(g/L)3min 10(g/L)5min 5(g/L)30min 故实践上常可用漂白粉、氯、高锰酸钾、过氧化氢等消毒。,3、毒性,（1）为已知的100多种霉菌毒素中毒性最大的，属强致癌性物质有报道说，其毒性比氰化钾更大，约大100倍，比B（a）P大4000倍，可对动物造成急性中毒，也可引起慢性中毒和致癌、致畸、致突变。它在WHO确定的重点研究毒物中被列为首位。1）各种 AFT的毒性大小并不相同：顺 序 B1 G1 B2 M1 G2 M2 B2a LD 0.36 0.78 1.7 3.2 3.5 12 240(50mg/kg)注：对鸭雏，LD50小于50mg/kg即为剧毒物 美国研究结论，1g/kgAFTB1可使大白鼠致癌；我国研究，20g/kg可使大白鼠致癌。,（2）与人致癌的关系 黄曲霉毒素高污染地区，其肝癌发病率明显较高。如江苏的启东，福建的铜安，广东的汕头，广西的抹援，为我国 4个肝癌高发病地区。,（2）污染 调查,很广泛，各种粮食中均可检出，核桃、乳及其制品、干辣椒中也有检出。但以花生、玉米、棉籽及其制品污染最为严重，稻谷、高粱其次，“三麦”甚微。（1）污染特点 玉米：胚部污染；花生、棉籽：整粒污染但仅限于少数颗粒；小麦：皮层污染。,（2）污染 调查,19761978年，粮食部组织，调查了18个粮种，取样19122个，检出7233个，检出率37.7%,其中超标率占49.2%。主要粮种情况（g/kg）：玉米，平均 400，最高10001200；(所以不要吃玉米)花生，平均 200500，最高50000；(所以不要吃花生)花生油，平均 400，最高8000；(所以不要吃花生油)稻谷（洞庭湖）平均 50100，最高330。(所以不要吃稻谷)总体分布，广西、福建、江苏污染最严重，山东以北诸省污染少。,5、限制标准（g/kg）,（1）GB 花生、玉米、花生油及其制品，20；大米及其它食用油，10；其它粮食、豆类、发酵食品，5；婴儿代乳品，不得检出。（2）国外标准（g/kg）FAO/WHO，15；美国，25；加拿大，15；日本，10；印度，30；以色列、瑞典，不得检出。,1.适用范围本方法适用于出口茶叶中黄曲霉毒素B1含量的检验。2.原理概要样品用三氯甲烷提取，提取液经硅胶柱净化，净化后的提取液用三氟乙酸衍生，用配有荧光检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。,3.主要试剂和仪器,3.1.主要试剂三氯甲烷；正己烷；苯；甲醇：紫外光谱级；乙腈：紫外光谱级；三氟乙酸；乙腈-水溶液(11)；三氯甲烷-甲醇溶液(955)；苯-乙腈溶液(982)；黄曲霉毒素B1标准品：纯度99%；黄曲霉毒素B1标准溶液：准确称取适量的黄曲霉毒素B1标准品，以苯-乙腈溶液于棕色容量瓶中，配成浓度为10g/mL标准贮备液。根据需要，再配成适当浓度的标准工作溶液。,3.2.仪器液相色谱仪，配有荧光检测器；硅胶小柱：Waters Sep-pak Silica前处理小柱或相当的硅胶前处理小柱；振荡器；旋转蒸发器，配有100mL具尾管的圆底烧瓶；微量注射器；离心管：5mL具塞磨口；粉碎机；滤膜：有机系用，0.45m；微孔滤膜过滤器：有机系用，0.5m。,4.试样的抽取与制备,4.1.检验批以不超过2000件为一检验批。同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格、等级等。4.3.抽样方法从整批产品堆垛的上下不同部位随机抽取2.2规定的件数，逐件开启。分别倒出全部茶叶于塑料布上，用取样铲从每件中各取出有代表性的样品约500g。将所取样品充分混匀，用四分法或分样器逐步缩分出500g，装入洁净密封的样品筒内，加封后，标明标记，及时送实验室。,4.2.抽样数量,批量，件 最低抽样数，件15 1 650 2 51500 11 5011000 16 10011500 19 15012000 20,4.4.试样制备将所取回样品全部磨碎，通过20目筛，混匀，均分成两份试样，装入洁净容器内，密封，标明标记。4.5.试样保存将试样于室温下保存。注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。,过程简述,5.1.提取称取试样5.0g(精确到0.1g)置于100mL具塞锥形烧瓶中，加入15mL三氯甲烷，于振荡器上提取30min，然后经垫有玻璃纤维的漏斗过滤。收集滤液于旋转蒸发器的具尾管圆底烧瓶内，并用三氯甲烷洗涤滤渣，收集滤液至5.2.净化用旋转蒸发器将上述滤液在50水浴中浓缩至约1mL，经0.45m滤膜过滤后，注入硅胶小柱中。用24mL正己烷洗涤烧瓶后淋洗小柱，弃去流出液。然后用34mL三氯甲烷-甲醇溶液以每秒钟2滴的流速洗脱，收集洗脱液于离心管中。用氮气缓缓吹干，供衍生用。,5.3.衍生,5.3.1.试样加200L正己烷和50L三氟乙酸于上述离心管中，盖紧磨口塞，超声振荡1min，静置10min，打开磨口塞，缓缓通入氮气至干。用乙腈-水溶液(11)定容至1.0mL，超声1min，用0.5m滤膜过滤，滤液供液相色谱用。5.3.2.标准工作溶液取1.0mL标准工作溶液，用氮气缓缓吹干，按步骤操作。,5.4.测定,5.4.1.色谱条件色谱柱：NOVA PAKc18，300mm3.9mm(内径)；流动相：甲醇-水溶液(4258)；流速：0.8mL/min；荧光检测器：激发波长375 nm，发射波长425 nm；色谱柱温度：室温。,5.4.2.测定根据样液中黄曲霉毒素B1的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中黄曲霉毒素B1衍生物的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液的衍生物溶液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，黄曲霉毒素B1衍生物保留时间约为8min。5.4.3.空白试验除不加试样外，按上述测定步骤进行。,6.结果计算,用色谱数据处理机或按下式计算试样中黄曲霉毒素B1的含量：XAcs/Asc式中：X 试样中黄曲霉毒素B1的含量，mg/kg；A 样液中黄曲霉毒素B1衍生物的峰面积，mm2；cs 标准工作溶液中黄曲霉毒素B1的浓度g/mL；As 标准工作溶液中黄曲霉毒素B1衍生物的峰面积，mm2；c 最终样液所代表试样的浓度，g/mL。注：计算结果需扣除空白值。,7.低限和回收率测定,7.1.低限本方法的测定低限为0.001mg/kg。7.2.回收率回收率的实验数据：黄曲霉毒素B1的添加浓度在0.0010.5mg/kg范围内，回收率为89.1%104.9%。,睡着了没大家，我讲完了,谢谢大家,
