2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课件冯惠坚.ppt

1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,课题2,尿素分子的立体结构,美国黄石国家公园的一个热泉,（一）筛选菌株,水生耐热细菌Taq(Thermus aquaticus)耐高温的Taq DNA聚合酶美国微生物学科布鲁克（T.Brock)1966年发现耐热细菌,选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,在本课题提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。,从物理性质看此培养基属于哪类？,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,（二）统计菌落数目,统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进行计数。,常用方法:稀释涂布平板法,原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞,？,说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,注意：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。,每克样品中的菌株数（CV）MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml)M：稀释倍数,（二）设置对照,一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,二.实验的具体操作.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,实验名称：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,（二）、制备培养基：准备牛肉膏蛋白胨培养基和制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,资料 二.样品的稀释,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,资料三、微生物的培养与观察,微生物的培养与观察,pH升高指示剂（酚红）将变红,答：不一定，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证(鉴定)。,鉴定原理：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,（09，安徽）下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1ml，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，370C恒温培养24-48小时D确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数,D,