微生物的遗传和育种.ppt

第七章 微生物的遗传变异和育种(Microbial genetics and breeding),遗传变异的物质基础基因突变和微生物育种基因重组和杂交育种基因工程菌种的衰退、复壮和保藏,内 容,第一节 微生物遗传变异的物质基础,一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验（一）肺炎双球菌的转化实验（二）噬菌体的感染实验（三）烟草花叶病毒的拆开与重组实验,遗传物质类型,核基因组,核外染色体,真核生物,细胞质基因,线粒体,叶绿体等,共生生物,2m质粒等,原核生物,F因子（F质粒）R因子（R质粒）Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒等,二、遗传物质在细胞中的存在方式,核基因组：又称染色体基因组或基因组，是一个物种的单倍体细胞核内的全部 DNA分子。基因：编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列。,（一）核基因组和基因,1、原核生物的基因组,(1)小，为双链的DNA分子，一般具有单一的复制起点；(2)基因组上遗传信息具有连续性；(3)功能相关的基因构成操纵子或形成重叠基因，且常转录为多顺反子mRNA(一个顺反子决定一条多肽链)。(4)基因组的重复序列少而短；(5)结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝。,细菌染色体DNA的大小和结构,乳糖操纵子,一半乳糖苷透性酶,-半乳糖苷乙酰转移酶,-半乳糖苷酶,（1）典型的染色体结构，大，具有许多复制起点；（2）一个基因组包含若干染色体，一般不呈环状；（3）功能上密切相关的基因集中程度不如原核生物，很少有关于操纵子的报道，一般为单顺反子；（4）基因不连续，分外显子和内含子；（5）有大量重复序列，有很多是不编码序列。,2、真核微生物的基因组,真核生物细胞中的DNA中只有不到5的DNA用于所需蛋白质的基因表达，其余的DNA起“结构”作用或“调节”作用。DNA被紧密地包装在多条染色体中，每条染色体中含有一个线状DNA分子，它以左手螺旋方向围着一个个组蛋白八聚体绕圈1.8周，形成串珠状的染色质，被串在一起的小颗粒称为核小体，染色质进一步卷曲形成每圈6个核小体、直径30 nm的染色质丝，它折叠成许多超螺旋环附着在中央骨架上。,真核生物的染色体结构,真核生物基因结构,3、基因的命名三字命名法（1）基因名称一般用三个小写字母表示，且排成斜体；例：赖氨酸基因：lysinelysLys（基因）（基因产物）（2）产生同一突变型表型的不同基因，用三个字母后面所加的斜体大写字母表示；例：组氨酸基因his;各组氨酸基因hisA；hisB（3）抗性基因，一般把“抗”用大写R注在基因符号右上角。如抗链霉素的基因为strR。,（二）原核生物的质粒,定义：是一类小型共价闭合环状的超螺旋dsDNA分子(circular covalently closed DNA,cccDNA)。大小：大小为1.5-300kb，相对分子量106108Da，携带有数个到数十个甚至上百个基因。,性质：质粒是一种复制子，根据自我复制能力的不同，分为严紧型复制控制和松弛型复制控制两种。在细胞质中独立存在，也可以整合入染色体上，以附加体的形式存在；对于细菌的生存并不是必要的。受理化因素影响，可消除。,功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。存在范围：很多细菌等。制备和鉴定：本质是DNA应用：基因工程中的载体。,（一）基因工程中应用的质粒,作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1、体积小，便于DNA的分离和培养；2、分子量相对较小，呈环状，化学分离过程中保持性能稳定；3、有不受核基因组独立的复制起始点；4、能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数；5、具有1个以上的遗传标志，便于筛选；,（1）pBR322质粒,（2）pUC质粒,2674bp,（1）F质粒,100Kb,转移区：负责合成和装配性菌毛（约28个基因）重组区：含有多个插入顺序，通过这些插入顺序进行同源重组 复制区：两个复制起始点：一个是OriS，供给F因子在宿主中自主复制时使用；另一个是OriT，供接合时进行滚环复制的起始点。,（二）几种典型的质粒,R100,抗性转移因子,抗性决定R因子,抗性转移因子：控制质粒copy数及复制抗性决定R因子含有各种抗性基因。,（2）R质粒,又称大肠杆菌素质粒或产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。大肠杆菌素都是由Col质粒编码的。,（3）Col质粒,200Kb,(4)Ti质粒,T-DNA的染色体整合机制,乙酰丁香酸羟基乙酰丁香酸,只在假单胞菌属中发现。降解性质粒是一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,（5）降解性质粒,近年来在根瘤菌属中发现的一种质粒，分子量为200300106Da，比一般质粒大几十倍到几百倍，其上有一系列固氮基因。,(6)巨大质粒,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变突变：指细胞内（病毒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。野生型：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株。突变体：发生了突变的微生物细胞或菌株。,按是否容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。非选择性突变株：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），检查大量菌落并找出差异。,（一）基因突变的类型,依表型的改变分为：营养缺陷型抗性突变型条件致死突变型形态突变型抗原突变型产量突变型,定义：某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。,（二）突变率,若干细菌某一性状的自发突变率,菌 名 突变性状突变率E.coli抗T1噬菌体3 108E.coli抗T3噬菌体1 107 E.coli不发酵乳糖1 1010E.coli 抗紫外线1 105S.aureus 抗青霉素1 107S.aureus 抗链霉素1 109 Salmonella typhi抗25g/L链霉素1 106 Bacillus megaterium 抗异烟肼5 105,（三）突变的特点,不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性：突变率低且稳定。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。,可诱发性：诱变剂可提高突变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变，从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变。,（四）基因突变的自发性和不对应性的证明,在各种基因突变中，抗性突变最为常见。一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。,1.变量试验-统计学原理,抗T1噬菌体的大肠杆菌的波动试验,2.涂布试验-突变率,突变率的计算,初始接种量：5 104 个/皿；培养5小时，繁殖了12.3代，每个菌落约含5100个细菌，这时每个平皿上的细胞数为：5100 5 104 2.6 108个/皿在6个平板上，比接种时增加的细胞数为：6（2.6 108 5 104）=15.6 108在未涂布的平板上共发现28个突变，故突变率=28/15.6 108=1.8 108,3.平板影印培养试验,1952年，J.Lederberg夫妇的论文影印平板培养法和细菌突变株的直接选择，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。,A,A,A,平板影印培养法,（五）基因突变的机制,1.诱发突变,诱变剂：凡能提高突变率的任何理化因子。种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。,（1）碱基置换,定义：只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。分类：转换：DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；颠换：DNA链中的一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。,直接引起置换的诱变剂,定义：可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂。（在体或离体都起作用）种类：很多。如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。,以亚硝酸为例：使碱基发生氧化脱氨作用。HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）HNO2腺嘌呤（A）次黄嘌呤（H）HNO2鸟嘌呤（G）黄嘌呤（X）,碱基转换的分子机制,腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（H）后引起的转换过程,烯醇式次黄嘌呤,酮式次黄嘌呤,这类诱变剂主要是一些碱基类似物,如：5-溴尿嘧啶（5-BU）和5-氨基尿嘧啶（5-AU）、叠氮胸腺嘧啶（AIT）等等；作用：通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。,间接引起置换的诱变剂,5-BU引起的转换,1,3,2,同一种诱变剂既可造成正向突变，又可产生回复突变。代谢类似物只对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子不起作用。,（2）移码突变,诱变剂使DNA分子中增加或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株。诱变剂:丫啶类染料和ICR类的化合物。,丫啶类化合物的诱变机制,至今还不很清楚。有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。,丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变,（3）染色体畸变,某些理化因子，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤-染色体畸变。包括：缺失、重复、易位、倒位、染色体数目的变化,在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序称转座因子，也称作跳跃基因或可移动基因。包括插入序列，转座子和转座噬菌体。DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其他染色体上某一部位的现象称为转座。,转座因子和转座,转座因子的特点,通过转座因子的复制，可将新形成的拷贝以非同源重组的方式转移到染色体的新部位上；携带有编码转座酶的基因，该酶是转移位置，是转座所必须的；两端各有一段一定长度的末端重复序列，既可以是正向重复，也可以是反向重复。,插入序列（insertion sequence，IS）,分子量最小（仅0.71.7kb），只能引起转座效应几乎不含其它基因。已知的IS有5种，即 IS1、IS2、IS3、IS4和IS5。E.coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通过这些同源序列间的重组，就可使 F因子插入到E.coli的核染色体组上，从而使后者成为Hfr菌株。,因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS引起的突变可以回复，其原因可能是IS被切离，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。,转座子（transposon，Tn）,Tn的分子量是居中的（一般为225kb）。它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其它基因。Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入。,Mu噬菌体（mutator phage）,是E.coli的一种温和噬菌体。与必须整合到宿主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同，Mu噬菌体并没有一定的整合位置。分子量最大（37kb），它含有20多个基因。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变。,转座子荣居自然界最丰富基因榜首位 在进化和生物多样性中扮演了关键角色自然界中的基因有千万种，哪类基因最为常见和最为丰富？由美国南佛罗里达州立大学、圣迭戈州立大学和芝加哥大学科学家组成的研究小组在对大量基因组进行成功解码后找到了答案，那就是有“自私DNA（脱氧核糖核酸）”之称的转座子。转座子基因的丰度和广度表明，它们在进化和生物多样性的保持中发挥了至关重要的作用。转座子因其独特的行为在科学界获得了诸多“名号”。目前仅知的功能就是到处传播自己，故有人昵称其“自私基因”；根据转座子可在生物体内或生物体之间移动，并产生不断变化的遗传物质的特性，也有人将其叫做“跳跃基因”。南佛罗里达州立大学海洋科学学院研究员米亚布赖特巴特称，转座子还有个称呼叫“剪贴基因”，它们能持续地改变和移动，有时甚至还能将其他基因一起带来。此项发表在最新一期核酸研究（Nucleic Acids Research）上的发现之所以引起广泛关注，不仅是因其给这些常见的DNA片段带来了新的认识，还在于科学家们在该项目中所进行的大规模的计算。该项目由圣迭戈州立大学牵头，使用了阿贡国家实验室的一台目前世界上最快的计算机用于测序分析。研究小组对数千种细菌、古细菌、真核和病毒的基因组序列以及数千种环境群落宏基因组中的蛋白编码基因和基因标签进行了分析。,布赖特巴特说，科学家们常在研究项目中使用转座子基因来进行各种实验，以对研究的生物体内的基因实施变异、破坏或是敲除等。但转座子也能带来新的功能，并创造出生物体内的多样性。研究人员表示，转座子基因在基因组中是如此的无所不在，以至于它们常常被忽略。它们能从一个地方迁移到另一个地方，引发出通常而言是有害的变异和重组，但偶尔其也能帮助生物体存活。生物学教科书一般认为在光合作用中能固定二氧化碳的酶是地球上最为丰富的酶，也据此推测能对这种酶进行编码的基因也应当是最丰富的。共同研究者之一、开罗大学的拉米阿齐兹表示，科学家们都会期待那些重要的基因会出现在自然界最丰富基因榜的前列，不过研究却发现，被某些科学家称为“垃圾DNA”的转座子反倒统治着已知基因世界。不过，转座子基因在整个自然界中并非均匀分布，有些基因组中有许多转座子基因，而另一些基因组中则缺失转座子基因。布赖特巴特表示，科学家们才刚刚开始理解转座子在环境中的存在和作用，这些极其成功的基因正到处扩散其DNA，制作大量的副本并侵入所有类型的生命体。在此前的研究中，已知转座子在人类基因组中占据40%的份额，不过从没有在不同生态系统中对其进行综合评估。阿齐兹表示，现在人们终于知道，在截至目前所采样的几乎每个生态系统中都有大量的此类基因存在，这些基因加速了变异和多元化的进程，从而驱动了不同生物体的进化。,2.自发突变,自发突变的可能机制环境因素；微生物自身有害代谢产物的诱变效应（过氧化氢）；DNA复制过程中碱基配对错误引起的。,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶比嘌呤对紫外线的敏感性。紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的嘧啶二聚体和水合物。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡或者突变。,1、光复活作用,定义：经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象。最早在灰色链霉菌中发现。最明显的是在E.coli的实验中：对照：8106个/ml E.coli U.V.100个/ml E.coli 试验：8106个/ml E.coli U.V.360490nm 2106个/ml E.coli 可见光，30分,300500nm,光解酶,黑暗,2、暗修复作用,1、核酸内切酶切开二聚体的5末端，形成3-OH和5-P的单链缺口2、核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。4、连接酶将新合成的3-OH与原有的5-P相连接。,第三节、基因重组,基因重组：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。换言之，不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。,原核微生物的基因重组形式：转化、转导、接合、原生质体融合 真核微生物的基因重组形式：有性杂交、准性生殖、原生质体融合,微生物进行的基因重组形式,一、原核微生物的基因重组,形式很多，机制原始，特点为：片断性，仅有一小段DNA序列参与重组；单向性，供体菌向受体菌做单方向转移；转移机制独特而多样，如接合、转化和转导。,（一）转化,1、现象,2、定义：受体菌在自然或人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得后者部分遗传性状的基因转移过程，称为转化。,2、有关名词：受体菌：转化基因的接受者；供体菌：转化基因的提供者；转化因子：供体菌的DNA片段；转化子：将转化基因重组进入自身染色体组的重组子。感受态：细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。,3、转化发生的条件：,受体细胞要处于感受态。,转化因子大小适宜。,菌株间的亲缘关系密切。,感受态由细胞的遗传性决定，但变现差别很大。感受态出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期。肺炎球菌的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期，芽孢杆菌的一些种则出现在指数期末及稳定期的初期。感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同。枯草芽孢杆菌不超过1015%，可维持数小时；肺炎球菌和流感嗜血杆菌达到100%，只能维持几分钟。同时也受环境因子的影响：cAMP、Ca2+等最明显。如用CaCl2 处理E.coli可以诱发其产生感受态。,感受态,感受态因子,转化因子：本质是供体DNA片段类型：一般的转化因子都是线状dsDNA；也有少数报道认为线状ssDNA也有转化作用。大小：15Kb左右，即约占细菌核染色体组的0.3%，其上平均约含15个基因。结合位点：位点有限，可发生竞争性结合并干扰转化转化频率：一般只有0.11%，最高时可达20%。,两个菌种或菌株之间在进化过程中的亲缘关系越密切越容易转化，但即使在转化率极高的菌种中，其不同菌株间也不一定都能发生转化。,以S.Pneumonia strr（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段：吸附：双链DNA片段与细胞表面的特定位点结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程；切割：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的DNA片段；入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞；,重组：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，于是形成了一个杂合DNA区段。复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,降解,吸附,切割成45106,单链入胞,同源部分配对、整合,复制分裂，只有一个子代DNA分子获得供体基因,4、转化过程,5、转化的类型：根据感受态建立的方式，可以分为：自然遗传转化人工转化（CaCl2和电穿孔法）,Try-his+,Try+his-,Try+his+,混合培养,A,B,（二）转导,1.转导的早期发现：J.Lederberg等（1952）在鼠伤寒沙门氏菌LT22A中发现的。,噬菌体作为介导,转导：以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。转导子：获得新遗传性状的受体细胞。,2.转导和转导子,3.转导的种类,完全普遍转导 普遍转导 流产普遍转导 转导 低频转导 局限转导 高频转导 溶源转变,（1）普遍性转导,普遍性转导,一个稳定的转导子的形成,第一次交换第二次交换交换完成，外源DNA掺入染色体组中,感染复数,吸附于细菌上的噬菌体数与培养中的细菌数之比，由于每一宿主细胞表面的特异性受体有限，因此所能吸附的噬菌体数目也有一个限量。每一敏感细胞所能吸附的噬菌体的数量，一般很大，可达250360。,定义：通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。,1.2 流产普遍性转导（abortive transduction）,概念：受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。,流产转导,2.局限性转导,定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。,特点：噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体；只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）；该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带；缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约105）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体）；局部转导的噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导裂解产生。,缺陷噬菌体的形成,2.1低频转导（LFT，low frequency transduction）：一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（104 106）。把这种裂解物称为LFT（低频转导）裂解物。用LFT裂解物以低 m.o.i（感染复数）感染宿主，就可获得极少量的局限转导子，即低频转导。,低频转导与高频转导,局限性转导,2.2 高频转导（HFT，high frequency transduction）当用LFT裂解物以高m.o.i 感染E.coli gal（不发酵半乳糖的营养缺陷型）菌株时，凡是感染有dgal噬菌体任一细胞，几乎都同时感染有正常的 噬菌体。这时 与dgal同时整合在一个受体菌的核染色体组上，从而使它成为一个双重溶源菌（double lysogen）。当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常 噬菌体的基因可补偿dgal缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。所以在双重溶源菌中的正常 噬菌体被称为助体（或辅助）噬菌体（helper phage）。,双重溶源菌的裂解物中含有等量的 和dgal粒子，具有高频的率的转导作用，称为HFT（高频转导）裂解物。用HFT裂解物以低 m.o.I 感染另一个E.coli gal（不发酵半乳糖的营养缺陷型）受体菌，就可以高频率地把它转化为能发酵半乳糖的E.coli gal+转导子，是高频转导。,E.coliK12+dg（双重溶源菌）(50%)+dg（50%）（高频转导裂解物）E.coliK12gal-(受体菌)E.coliK12,低频转导,高频转导,U.V.,U.V.,双重溶源菌E.coliK12(/dg),转导噬菌体（dg）+辅助噬菌体（）,转导子菌落,噬菌斑,U.V.,普遍性转导和局限性转导的比较,3.溶源转变,概念：当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。性质：表面上与转导相似，而本质上不同于转导。,区别：温和噬菌体是完整的，不是缺陷的；温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主获得新性状；获得新性状的是宿主细胞溶源化的表型，而不是经遗传重组形成的稳定转导子；当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失。,典型实例,Corynebacterium diphtheriae（白喉棒杆菌）：白喉毒素/温和噬菌体Clostridium botulinum（肉毒梭菌）：C型或D型肉毒毒素/温和噬菌体Salmonella anatum（鸭沙门氏菌）：细胞表面多糖/E15噬菌体Streptomyces erythreus（红霉素链霉菌）：红霉素合成和气生菌丝形成/P4温和噬菌体,（三）接合,定义：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，前者传递不同长度的DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。（通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。）通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant）。,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（Bernard Davis，1950）,存在范围：细菌：G 较为多见如E.coli、Salmonella（沙门氏菌属）、Shigella（志贺菌属）、Serratia（沙雷氏菌属）、Vibrio（弧菌属）、Azotobacter（固氮菌属）、Klebsiella（克雷伯氏菌属)和Pseudomonas等最为常见。放线菌：Streptomyces（链霉菌属）、Nocardia（诺卡氏菌属）。接合还可发生在不同属的菌种之间，如E.coli与Salmonella typhimurium（鼠沙门氏菌）之间或S.typhimurium与Shigella dysenteriae(痢疾）之间。,E.coli的四种类型,F（“雌性”）菌株：细胞中不含有F因子，细胞表面不具有性菌毛。可以通过与F+、F或Hfr菌株接合而接受供体菌的F因子、F因子或Hfr菌株的部分或全部遗传信息，相应地可以转变成F+菌株、F菌株或重组子。据估计，从自然界分离到的2000株E.coli中约有30%是F菌株。,F+（“雄性”）菌株：细胞内含有（14个）游离的F因子，细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛。与F 相接触时，可通过性菌毛将F因子转移到F 细胞中，使之也变成F+菌株。F因子以很高的频率传递，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般并不被转移。,接 合,接合的一般过程,Hfr菌株：含有与染色体特定位点整合的F因子（游离态整合态）。与F菌株接合时，引起转性的频率最低，但可以出现各种重组子。,接合中断试验与染色体图：,接合中断试验：由Wollman和Jacob首创（1955），首先认识了原核微生物染色体的环状特性。原理：接合试验的DNA转移过程存在着严格的顺序性，在接合进行中采用定时人为中断的方法，可以获得呈现不同数量 Hfr 性状的 F 接合子，据此，可以选定几种有特定整合位点的 Hfr 菌株，使之与F菌株进行接合，并在不同时间使其中断，最后，根据F中出现Hfr菌株中各种形状的时间顺序（分钟），可以绘出较为完整的环状染色体图。到1983年E.coli染色体上已定位1027个基因。,接合中断试验,Hfr中F因子的整合、断裂和转移,a,b,c,d,e,F菌株：细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状F因子，可与F 菌株接合，使其成为F菌株。F菌株的形成：由Hfr菌株中的F因子在不正常切离而脱离核染色体组时所形成，并因此造成细胞染色体发生缺失。由Hfr异常释放所生成的F菌株，称为初生F菌株；由F接受外来F因子所产生的F叫作次生F细胞；,F因子转导（F-duction）,由F因子来传递供体基因的方式，称为F因子转导、性导（sexduction）或F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。因为F因子可在细菌的染色体多位点整合，所以F因子转导可实现不同基因的转移和重组。,图：初生F菌株和次生F菌株的由来,F F F+F,F因子的存在方式,（四）原生质融合（原核、真核）,（二）真核微生物基因重组,有性杂交,准性生殖,1、有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。能产生有性孢子者，均可采用有性杂交。,2、准性生殖：在同种而不同菌株的体细胞间发生的融合，不借减数分裂而导致的低频率基因重组并产生重组子的生殖方式。一种类似于有性生殖但较原始的生殖方式。,菌丝联结,异核体形成（能独立生活）,核融合（低频）,体细胞交换和单倍体化,有丝分裂的交换,一般来说，体细胞在有丝分裂过程中，同源染色体间是不会发生交换的，这样杂合二倍体细胞繁殖形成的后代仍和亲代细胞相同。但准性生殖形成的杂合二倍体偶尔会发生染色体间的交换。由于这种交换发生在有丝分裂而不是减数分裂中，因此称为有丝分裂交换，即体细胞交换。所谓有丝分裂交换，就是在有丝分裂过程中，同源染色体之间发生的交换。,单倍体化,染色体单倍体化的过程不同于减数分裂。染色体单倍体化包括一系列非典型的和不规则的二倍体核的有丝分裂。在有丝分裂后期，如果姐妹染色单体未分开，或者一个染色体分开以后都移向细胞的一极，这样就会造成所形成的子核染色体数目不相等（2n+1和2n-1）的非整倍体。2n+1的非整倍体又称为三体，常常失去一个染色体而成为正常的杂合二倍体，或者产生对一条染色体来说是纯合的二倍体（重组型二倍体）；2n-1非整倍体又称为单体，则趋向于单倍体化，即在分裂过程中，连续丢失染色体，最终产生包括重组类型在内的各种单倍体。,一、菌种的衰退与复壮的概念1.衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。衰退的原因：基因突变，分离现象。常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；,第六节 菌种的衰退、复壮及保藏,2、防止菌种衰退的方法：控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是510-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；选择合适的培养条件；采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；采用有效的菌种保藏方法。,3、菌种的复壮使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。,4、菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）；淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。采用有效的菌种保藏方法。,二、菌种保藏：1.目的：存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种2.原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,菌 连续在培养基上（内）移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上,干法保藏菌种的方法,滴入小试管（在放入大试管干燥器中）藏在玻璃管内 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法（L-干燥法 冷冻真空干燥法 细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒）球块状载体（硅胶、瓷球）合适的载体 有机基质（曲料、麦粒）滤纸片 薄片状载体 明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）血清蛋白小片（乙烯薄膜）,几种常用菌种保藏方法的比较,3、方法：低温保藏法方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。,真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。,