微生物的利用-微生物的选择培养和计数.ppt
微生物的应用土壤中微生物的分离与计数,实验设计一,实验目的：（1）从土壤中能分离出能够分解尿素的细菌（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,实验原理：（1）尿素CO（NH2）2，可以被含有脲酶的微生物降解，降解成氨后可以被植物吸收，是重要的农田氮肥（2）尿素略呈中性，如果被分解将产生NH3，溶液略呈碱性（3）尿素高温、高压下会被降解,过滤灭菌：使用0.22m 孔径过滤器,尿素的灭菌,可供参考的资料,资料1：土壤是“微生物的天然培养基”，土壤中的微生物大约70%90%是细菌，主要分布在距地表约38cm的土壤层资料2：样品稀释程度直接影响平板上生长的菌落数，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间，适于计数的平板资料3：不同微生物需要不同的培养温度和时间，细菌一般在3037的温度下培养12d；放线菌一般在2528温度下培养57d；而霉菌一般在2528的温度下培养34d；定期观察菌落的形态 特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等，统计并记录数据,以尿素为唯一氮源的固体选择培养基尿素、细菌过滤器土壤原液、装有无菌水的试管、移液器、枪头培养皿、涂布器（三角刮刀）酒精棉球、镊子酒精灯、火柴记号笔,可以参考的实验用具,可供使用的实验技术,1.培养基的制备技术2.无菌操作技术3.接种技术4.培养技术5.微生物的数量统计技术（计数）：在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是 稀释涂布平板法。除此之外，显微镜直接计数 也是测定微生物数量的常用方法。,稀释涂布计数法,采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于 样品稀释液中一个活菌。通过统计 平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30300 的平板进行计数从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是（平均菌落数涂布的稀释液体积）稀释倍数。利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是 恰当的稀释度。,显微直接计数法,又称为血球计数板直接计数观察到的红细胞平均数观察到的细菌平均数红细胞含量细菌含量,血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网。如左图。,显微直接计数法（血球计数板直接计数）,每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室构造如左图。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即1625=400小方格，如左图。,计数室,血球计数板,2516,1625,每一个大方格边长为l mm，则每一大方格的面积为l mm 2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1 mm，所以计数室的容积为0.1 mm3。设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数(即0.1mm3中的总菌数)为A/525B。因为:1 ml=lc m3=1 000mm3，故:l ml菌液中的总菌数为：A/525l0l 000B,可供参考的实验流程,可供参考的实验流程,请依据实验目的、原理和可供参考的资料和实验流程进行实验设计并将方案写在学案的相应位置,实验设计方案,土壤微生物种类最多、数量最大的原因是什么？土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。29 实验过程：1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。2）应在火焰旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。,结果分析和评价,对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助 生物化学 的方法。32在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 脲酶 将尿素分解成了 氨。氨会使培养基的碱性 增强，PH 升高。因此，我们可以通过检测培养基 pH 变化来判断该化学反应是否发生。33在以 尿素 为唯一氮源的培养基中加入 酚红 指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变 红，说明该细菌能够 分解尿素。,设计过程中应思考的问题,1.如何进行实验设计2.设计时为了避免一些无关实验因素对于实验可信度的影响，我们该采取怎样的措施？3.在对菌落进行计数时，为了避免一次实验的偶然性，我们该采取怎样的方法以减少误差？,设置对照实验,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。,配制培养基,尿素培养基（1L）葡萄糖 10g NaCl 4.8g K2HPO4 4.8g 琼脂 20g 酚红 0.01g 尿素 2g,LB培养基（1L）蛋白胨：10g 酵母粉：5g NaCl：10g 琼脂：20g,对照组,选择培养基,实验组,操作流程及示意图,1 培养基的制备及灭菌2 准备器皿和材料3 采集土样,实验前的准备工作,1.称取待测液样品土l0g，放入装有90ml无菌水的250ml三角瓶中，振荡20分钟，使细胞分散，静置2030秒，即成10-1稀释液。2.再用1ml移液器，吸取10-1稀释液1ml，移入装有9ml无菌试管，即成10-2稀释液。再换一支无菌枪头取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管，摇匀，即成10-3稀释液。以次类推，连续稀释，制成10-4稀释液。,土壤稀释液的制备,稀释涂布平板法,取100l（0.1ml）稀释液进行涂布,实验结果,实验拓展,练习题,1、选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。,阻止,特定,抑制,2、常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有 直接计数。,显微镜,稀释度,细菌,30-300,3、在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,平均数,4、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是 A涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233,D,5.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因可能有()由于土样不同 由于培养基污染 由于操作失误 没有设置对照 A B C D,A,Thank You!,
