微生物学实验3-11-cm.ppt

实验3 实验室环境及人体表面微生物的检查分离,目的要求,1.证实实验室环境与人体表明存在微生物。2.体会无菌操作的重要性。3.观察不同类群微生物的菌落形态特征。4.无菌操作，将分离的典型菌落划线培养于固体斜面。,原理,通过培养的方法使 肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌聚集在一起的肉眼可见的菌落。,操作步骤,1.做好标记,2.不同样品采集,3.平板倒扣37或室温培养,a,b,c,d,请注意无菌操作,思考题,体会,实验报告,根据p8表格填写实验报告。,实验4 显微镜的使用及细菌的简单染色法,p43,6.双眼同时睁开观察，减少眼睛疲劳，且可同时画图和记录。7.可不佩戴眼睛操作，注意不要压破载玻片，不触碰样品处8.双眼聚焦于同一个视野。,油镜使用,待后面演示,简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞的构造。,用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料如伊红美蓝、伊红天青等。,三、实验材料,奥林巴斯普通光学显微镜（复式显微镜）同学们分离纯化培养的不同菌株草酸铵结晶紫染液，齐氏石炭酸复红染液载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。,（一）、制作细菌观察片（单染色）,（1）涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，用另外一个载玻片向一侧推菌悬液滴一次，涂成薄膜，涂布面积约11.5cm2。（2）干燥将涂片于室温中自然干燥。（3）固定手执载片端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火23次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。,（4）染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。（5）水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。（6）干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体。（7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。,一,二甲苯有毒，同学请注意安全，且会腐蚀镜头，不宜使用过多,注意事项,1载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多（1小黄豆），挑菌量宜适中，菌膜宜薄，切忌过厚（不要来回涂抹）。2在染色过程中，不可使染液干涸。3.无菌操作，接种环一定要冷却后再取菌。4.涂片干燥后加热固定，加热时间不宜过长（3-6次）,问题和思考,1涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？3.使用油镜时，为什么必须用香柏油？4.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？,五、实验报告,(一)绘图（细菌形态图）P46(二)单染色法操作要点。,实验4 革兰氏染色法荚膜染色,一、实验目的,目的：1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术;2.学习革兰氏染色法以及荚膜染色法；3.掌握染色原理。,二、原理,革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G)和革兰氏阴性菌(G)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄(10nm,2-3层)、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚（20-80nm，15-50层）且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。,金黄色葡萄球菌革兰氏染色图,大肠杆菌革兰氏染色图,革兰氏染色的实际意义(1)鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类,这样可将致病菌的范围缩小,然后再进一步鉴定.(2)选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗菌素等药物的敏感度不一.例如大多数阳性菌对青霉素敏感，大多数阴性菌对青霉素不敏感(脑膜炎球菌等除外),可供临床实践中选用抗菌药物的参考.(3)与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为,荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，含水量大，其他成分多为多糖、多肽或糖蛋白。细菌荚膜染色的原理是因为荚膜和染料间的亲和力弱，不易着色，且易被水洗去，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90以上，固染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。,荚膜功能：抗吞噬作用：荚膜因其亲水性及其空间占位、屏障作用，可有效抵抗宿主吞噬细胞的吞噬作用。粘附作用：荚膜多糖可使细菌彼此间粘链，也可粘附于组织细胞或无生命物体表面，是引起感染的重要因素。抗有害物质的损伤作用：处于细菌细胞最外层，荚膜犹如盔甲可有效保护菌体免受或少受多种杀菌、抑菌物质的损伤，如溶菌酶、补体等。抗干燥作用：荚膜多糖为高度水合分子，含水量在95%以上，可帮助细菌抵抗干燥对生存的威胁。,形成条件：荚膜的形成与环境条件密切相关。一般在动物体内或含有血清或糖的培养基中容易形成荚膜，在普通培养基上或连续传代则易消失。,三、实验材料,革兰氏染色：（1）黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌（E.coli）斜面；（2）革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95乙醇、石炭酸复红液等)、（3）香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。,四、实验步骤,菌体适中，玻璃涂成薄膜，不宜太厚，用后接种环用火焰灭菌。,制作涂片,晾干，易于染色,固定，强度适中，不宜烫手,初染,1-2min，所有染色过程染液不可干涸,水洗至无色,媒染,先冲去残留水，媒染1min，水洗并沥干,脱色,脱色至流出液为无色，一般20-30s-1min，水洗并沥干。整个过程不要靠近火焰。,复染,1-2min，所有染色过程染液不可干涸,water,水洗，晾干，镜检。,注意事项,1、染料避免干涸，酒精脱色务必避开火焰。2、老龄菌易被染成红色（细胞通透性出现变化），造成假阳性。一般选用生长活跃的菌体进行染色。（18h-32h）3、涂片过厚或菌悬液过浓，导致细胞大量堆积，容易导致脱色不完全，造成假阳性。染色结果以分散良好的细菌染色结果为准。4、酒精脱色不够导致假阳性，脱色过渡导致假阴性。5、控制好染色区域，保证整个染色过程及最后镜检在同一个区域进行，可用铅笔标记。,思考题,可用什么方法证明革兰氏染色是成功的？（混合涂片）革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？革兰氏染色哪一步最关键？,五、实验内容及结果,大肠菌、金黄葡萄球菌革兰氏染色，绘图，并记录染色结果（颜色，G+或G-）及放大倍数（包括物镜及目镜）。,荚膜染色,实验材料：(l)生技术班同学培养的一株细菌（SJJM）(2)石炭酸复红染色液、黑色液（墨汁）。(3)载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜。,实验步骤,1制片：在干净载玻片一端滴一滴无菌水，取少许细菌在水滴中制成悬液。取一小滴新配好的黑色素溶液（也可用墨汁）与菌悬液混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以30度角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。2固定：用纯甲醇固定1分钟，立即倾去甲醇，自然晾干。3染色：加结晶紫/番红/碱性复红/甲基紫染液数滴于涂片上，染1-2min，以细水流适当冲洗，吸去水后自然晾干。4.油镜观察结果。先用低倍镜再高倍镜观察。结果：背景黑色，菌体紫色或红色，荚膜呈一清晰透明圈。,注意事项,1、玻片干净无油脂。2、墨水使用量适中，关键是涂片要薄。3、整个过程不加热，固定使用甲醇，甲醇有较强的毒性，对人体的神经系统和血液系统影响最大，请同学使用过程特别留意。,思考题,1、荚膜染色，为什么不能热固定？2、荚膜负染法，荚膜为何不着色而菌体着色？3、在荚膜Anthony氏染色法中，硫酸铜溶液的作用是什么？,实验内容及结果,菌株SJJM 荚膜染色，绘图，记录染色结果（菌体及荚膜形态）及放大倍数（包括物镜及目镜）。,球菌：SJJM菌株光学显微镜图（简单染色）放大倍数：1000倍,存在的其他问题：细菌形态不规则，菌体有缺口，多种形态细菌混杂而未标注。,实验5 细菌芽孢和鞭毛染色,一、实验目的,目的：1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术;2.学习并掌握细菌芽孢和鞭毛的染色方法及染色原理；3.了解细菌芽孢和鞭毛的形态特征。,细菌芽孢染色,芽孢是菌种分类鉴定的重要指标，在菌落形态上也有其相关特征。形成芽孢的细菌菌落表面一般为粗糙不透明，常呈现褶皱,枯草芽孢杆菌菌落,1 背景知识,有些细菌（多为杆菌）在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的圆形、椭圆形或圆柱形的休眠体。1个细菌细胞只形成1个芽孢，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。在有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，这些细菌称为芽孢杆菌，为好氧细菌；在另一些细菌中，芽孢的直径大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓塑形，这些细菌称为梭状芽孢杆菌。产芽孢的细菌多为杆菌，在球菌和螺菌中，只有少数种类有芽孢，球菌中只有芽孢八叠菌（Sporosarcina）属产芽孢。弧菌中只有芽孢弧菌属(Sporovibrio)产芽孢。,1背景知识,芽孢的形成过程,1背景知识,芽 孢 的 结 构,1背景知识,2染色 原 理,染色特性：芽孢壁比营养细胞的细胞壁结构复杂而且致密，透性低，着色和脱色都比营养细胞困难。一旦着色，又难以被水洗脱。,解决办法：一般采用碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都同时染上色后，再用脱色剂冲洗，脱去菌体的颜色，但仍保留芽孢的颜色。并用另一种对比鲜明的染料使菌体着色（复染），如此可以在显微镜下明显区分芽孢和营养体的形态。通常，芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热的条件下进行。染色完毕，用蒸馏水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，因此易被水冲洗掉，而进入芽孢的孔雀绿却难于溶出。水洗后，再用一种呈红色的碱性染料复染，使菌体和芽孢呈现不同颜色。,3 实 验 材 料,仪器及器材：显微镜、酒精灯、试管夹、接种环 载玻片、镊子、洗瓶、吸水纸、擦净纸。,试剂：5%孔雀石绿、0.5%番红复染液、香柏油、二甲苯,菌种：LB斜面上培养2448小时枯草芽孢杆菌和SGLL菌株斜面。,4 染色步骤,菌悬液、涂片、干燥、固定,3-5滴,充分水洗,充分水洗,染色结果：芽孢绿色，菌体红色。,16h,48h,16-48h之间,枯草杆菌石炭酸复红染色图片,枯草杆菌吕氏美蓝 染色图片,5 注意事项,1.选用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢囊为宜，取菌适中。2.涂片要薄，且固定时的温度控制好；3.加热染色要用微火，加热过程中要及时补充染液，切勿让染液干涸；4.染色时间的掌握；5.水洗时水流不能急，不能冲有菌的一边；6.孔雀石绿 有高度毒性.,思考题,芽孢染色为什么要加热？为什么经孔雀绿染色后，水洗再复染红色染液只能染上菌体？用革兰氏染色能否看到芽孢？,6 实验报告,绘制芽孢染色图。对染色结果进行简单分析描述。注意芽孢在菌体内的位置、大小和形状；注意芽孢的颜色和菌体的颜色。,细菌鞭毛染色,1 背景知识,鞭毛(flagellum,复flagella)生长在某些细菌体表的长丝状、波状弯曲的蛋白质附属物称为鞭毛，其数目为一至数十条，具有运动功能。鞭毛的长约1520mm，直径为0.010.02mm，鞭毛细长透明。,鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛以及鞭毛的着生位置是细菌的一项重要形态特征。大多数球菌无鞭毛，有些杆菌生有鞭毛，螺旋菌都生有鞭毛。幼龄菌运动活泼，老龄菌运动性差或失去鞭毛不能运动。（水制片观察-泳动或旋转，减弱光照强度）,观察和判断细菌鞭毛的方法：电子显微镜直接观察 光学显微镜下观察：鞭毛染色和水制片 根据培养特征判断：半固体穿刺、菌落（菌苔）形态,细菌鞭毛(flagellum)电镜照片（引自“Foundations of Microbiology）,侧生、端生、周生,2 染色原 理,鞭毛的染色特性：细菌的鞭毛细长透明，直径一般为1020nm，其宽度在普通光学显微镜波长检验范围之外，只有用电子显微镜才能直接观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。,解决办法：鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色，便可达到普通光学显微镜的辨析范围以内。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。,菌龄选择：鞭毛菌只有在一定群体和个体发育阶段才产生鞭毛。一般外界条件适宜时，菌龄年轻的培养体易产生鞭毛，菌龄老的培养体鞭毛容易脱落。菌落或菌苔尽量取边缘部分菌体。,3 实 验 材 料,仪器及器材：Motic显微镜、酒精灯、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、洗瓶装蒸馏水、吸水纸、擦净纸。,菌种：在LB斜面上培养1836小时的SG2和SJxyz菌株.,试剂：硝酸银染色液（新鲜配制）、香柏油、二甲苯。,4 实 验 内 容,细菌运动性观察（选做）,水制片1.制片用滴管取菌悬液一小滴，置于干净的载玻片中央，以倾斜法加上盖玻片（勿使产生气泡）2.镜检将载玻片置显微镜下，用低倍镜、高倍镜观察细菌运动的情况。,鞭毛染色,硝酸银法：清洗玻片菌液的制备及制片滴加A液，染810min 蒸馏水充分洗净A液用3-5滴B液涤去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上微热至冒气，约维持0.51min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区用蒸馏水洗，自然干燥镜检,染色结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。,轻轻沾洗下菌体，成菌悬液，倾斜让菌悬液从玻片一侧流向另一侧，由流过的水痕形成菌薄膜,5 注意事项,1菌龄，挑取菌苔边缘幼龄的菌体。2所用玻片要选择光滑无划痕的，干净无油脂。3染色液一定要新鲜，特别是硝酸银染色法中更是如此，A染液和B染液最好都现用现配。,4取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾洗下菌体即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开，将载片稍倾斜，使菌液自然滑落形成水膜，否则鞭毛易脱落，造成染色失败。5.鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。6.染色后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分，否则背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验效果。,6 思考题,、菌种的培养时间与鞭毛染色有什么关系？、你在显微镜下看到的鞭毛是否为原来的大小、鞭毛涂片与芽孢涂片有何区别？为什么？,7 实验报告,绘制鞭毛染色图，并对实验结果进行分析描述注意显微镜下检查鞭毛染成什么颜色和形状、比较菌种鞭毛着生的位置、数目,革兰氏染色效果良好荚膜染色效果差-无荚膜或荚膜不明显，黑色素染液涂片的厚度及顺序（制作方案）绘图进步较大，但菌体比例尚需注意放大倍数仍有人出错,球菌：SJJM菌株光学显微镜图（简单染色）放大倍数：1000倍,存在的其他问题：细菌形态不规则，菌体有缺口，多种形态细菌混杂而未标注。,实验八 酵母菌的形态观察、大小的测定和计数,酵母菌的形态观察,背景知识,酵母菌是一个通俗名称，一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌。酵母菌能发酵糖类产能，其生境一般为高糖、偏酸。,一 实验目的,1.观察酵母的形态及出芽生殖方式2.学习区分酵母菌死活细胞的鉴别方法,背景知识,宏观 菌落特征：和细菌菌落极为相似，表面湿润、粘稠，与培养基结合不紧密，易挑起。但比细菌菌落大而厚，颜色比较单一，大多乳白色、只有少数为红色、黑色等，不同种类的菌落在形态、质地和边缘特征上均表现不同。菌落光滑或起皱，平整或突起，边缘圆整或有不规则的毛状物。菌落特征可作为酵母菌菌落鉴定的依据之一。（总之，酵母菌细胞较细菌细胞大10倍左右，表现在菌落形态上就有酵母菌的菌落直径较大、菌落隆起明显等特点）,细胞结构,微观：酵母菌是单细胞的真核微生物，细胞核和细胞质有明显分化，个体直径比细菌大几倍甚至几十倍，大小约1-55-30微米。最长的可达100微米。,酵母菌的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。,酵母菌繁殖方式为无性繁殖和有性繁殖两种。正常情况下以无性繁殖为主，无性繁殖主要方式是出芽方式，有的是分裂繁殖；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊孢子。,成熟的酵母菌细胞，先长出一个小芽，芽体细胞长到一定程度，脱离母细胞继续生长，尔后形成新个体。有多边出芽、两端出芽、和三边出芽。,芽痕-蒂痕（啤酒酵母）,根据酿酒酵母细胞表面留下芽痕的数目，就可确定某细胞曾产生过的芽体数，因而也可用于测定该细胞的年龄。在任何酵母群体中，50的细胞是由最近一代的细胞分裂所产生的，故在其表面仅有一个蒂痕而无芽痕；在其余50细胞中，25具有一个芽痕，12.5具有两个芽痕，而12.5则具有两个以上的芽痕。,二 染色原理,由于细胞个体大，采取涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美兰染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，是活体染料的一种，是碱性染料。它的特性是氧化态呈蓝色，还原态呈无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或新陈代谢微弱的衰老细胞呈蓝色和淡蓝色，借此即可对酵母细胞进行死活鉴定。,三、实验材料：,1.菌种 啤酒酵母斜面2.染液 吕氏碱性美蓝液3.器材及用具 接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸管、镊子、显微镜、恒温培养箱。,酿酒酵母菌细胞形态多为卵圆形，在高倍镜下清晰可见，并可观察到其细胞内的液泡及颗粒状内含物，但观察不到细胞核。芽殖的形态为：在较大的母细胞上生长着较小的子细胞，两者间呈藕节状连接。细胞呈无色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞或衰老的细胞。,注意事项,制备菌悬液时，不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。水制片，染料或蒸馏水不宜过多或过少，否则在盖上盖玻片时，菌液容易溢出或产生气泡，影响观察。盖玻片不宜平着放下，应倾斜慢放，避免产生大量气泡。注意区别出芽与酵母菌重叠的情况。,五、实验结果,图示酿酒酵母菌的细胞、芽殖形态。对实验进行简单分析、描述。记录死、活细胞的大致比例P75。思考题：1.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的形态特征区别于一般细菌。2.吕氏碱性美蓝染液浓度及作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量计数有什么影响，试分析其原因。,微生物细胞大小的测定,一.实验目的,学习测微技术，测量酵母细胞的直径（宽度）和长度。,二.实验原理,微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一。由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。光学显微镜中，用来测量细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺,目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于在显微镜不同的接目镜和接物镜系统下，放大倍数不同，目镜测微尺每格所示长度随显微镜放大倍数而变化。所以在使用前，须用镜台测微尺来校正目镜测微尺。,镜台测微尺形如载玻片，在中央的圆形盖片下，有一长为1mm的刻度，精确等分为100格，每格长10m。故用已知长度的台尺校正目尺，即可求出目尺一格的长度。,三.实验器材,1.菌种酵母菌悬液2.器材目镜测微尺、镜台测微尺、显微镜、盖玻片、无菌滴管、双层瓶、擦镜纸等。,四 实验步骤,1.将目镜测微尺装入目镜内，刻度朝下，并将镜台测微尺置载物台上。2.用低倍镜观察到镜台测微尺的刻度。3.换用高倍镜测量，先用镜台测微尺标定。计算出目镜测微尺每格的长度。移动镜台测微尺和转动目镜测微尺，使二者的刻度平行，并使两尺的第一条线重合。向右寻找另外相重合的直线，记录两重合刻度间目镜测微尺和镜台测微尺的格数，由公式算出目镜测微尺每格长度。,五.实验报告,将实验结果记录于，表中,注意事项,光线调节，不宜太亮，以免找不到台尺菌体不同生长阶段细胞大小变化大，以对数生长期的菌体材料为宜，但直径相对稳定。,实验完毕注意事项,台尺回收，交于老师；清理显微镜物镜及台面卫生，显微镜按编号放回厨子 上交前两次实验的实验报告（给学习委员）本次预习报告签字,作业点平（芽孢、鞭毛染色）,芽孢脱落芽孢大小，是相对于菌体而言芽孢未染上颜色的原因时间及温度鞭毛脱落或无（染色浅）-时间、温度鞭毛是否周生或侧生或端生分辨不清鞭毛颜色相对于细菌而言，较浅,画图要求,1.具有高度的科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。2.图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。3.绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。4.绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。5.绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。6.绘图完成后在图的下方注明图名及放大倍数,微生物的显微直接计数,一、目的要求了解血球计数板构造和原理 学会用血球计数器测定酵母菌细胞数,二、基本原理-计数,用血细胞计数板计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格框共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。由于计数室的容积是一定的（0.1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。,1 2 3 4,不可用油镜,9个大格,计数室宽1mm,25中格16小格 16中格 25小格,计数时，先数五个中方格的总菌数，求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，得出大方格的总菌数，再换算成1ml菌液中的总菌数。,三、材料与器材,1、材料 酵母菌悬液（自己制备）2、器材 血球计数板、显微镜、盖玻片、滴管等。,四、操作步骤,1 稀释 将酵母菌悬液进行适当稀释。2 镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。（清洗，晾干）,3 加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用干净细口滴管将稀释均匀的酵母菌液滴入（不宜过多或过少，从一侧的沟槽慢慢滴入，让其自然漫过计数室，至对侧沟槽充满菌液为止），静置5-10min即可计数。,4 显微镜计数先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜（40倍）进行计数。（有的显微镜40倍物镜不佳，届时需要协调使用）5.清洗清洗计数板：用水柱冲洗血球计数板，吹干。镜检，确认无残留物。计数板干燥后装回盒子，交回实验室老师，以备后用。清洗显微镜物镜并整理好台面卫生。,注意事项:,制备菌悬液，避免刮取到培养基；取样时先要混匀菌液;加样时计数室不可有气泡产生；加样量适中；调节显微镜光线的强弱适当；计数板上刻度精细，清洗勿用刷子或硬物，也不可用酒精灯火焰烘烤。,对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。,数上不数下，数左不数右,五、思考题,1、用血球计数板计数时，哪些步骤易造成误差？2、血球计数板测定原理是什么？它有哪些优点及缺点？p523、用两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果一样？,六、实验报告,1 ml菌液中的总菌数=A/525104 B,实验 9 水的细菌学检查 1.水中细菌总数的测定,一、目的要求,（1）学习并掌握水体中细菌总数的检验方法、检验的原理、数据处理和报告方法。（2）强化水体细菌总数检验的卫生意义知识。,背景知识,水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关。因此，它是评价水质污染程度的个重要指标之一。细菌总数越大，说明水体被污染得越严重。由于重金属及某些其它的有毒物质对细菌有杀灭或抑制作用，在总细菌数少的水样中并不能排除这些物质的污染。,良好饮用水 细菌总数应小于100CFU/mL(colony forming units),而大于500CFU/mL则不适宜饮用。我国饮用水卫生标准（GB5749-85）规定每毫升水样细菌总数37培养24小时不得大于100CFU。,二、基本原理,本实验应用平板计数技术（稀释混合平板法、稀释涂布平板法）测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。,三、实验材料,1.水样的采取：（1）自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。（2）池水、河水或湖水应取距水面1015cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。2.其他实验材料牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水；灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，EP离心管及架子，培养箱等,四 实验步骤（稀释涂布平板法）,1）自来水（a）用灭菌吸管吸取0.2水样，注入肉膏蛋白胨琼脂平板中。共做2平皿。（b）无菌操作用涂布棒（自己制备）均匀涂布至水样全部吸入琼脂 平板中。（c）琼脂平板倒置于37温箱中，培养24小时，进行菌落计数。可设置一个空白对照。两个平板的平均菌落数乘于5即为1ml水样的细菌总数。,（2）池水、河水或湖水等,1.吸取0.1mL水样(河水、污水或游泳池水等)，注入盛有0.9mL无菌水的EP离心管中，混匀成10-1稀释液，注意在吸水样前，水样及稀释水应彻底搅动均匀。2.吸稀释液0.1ml按10倍稀释法稀释成10-2、10-3、10-4等连续的稀释度。3.吸取由高倍至低倍的稀释液，每个稀释液分别注入两个琼脂平板中，每皿0.2mL，无菌操作用涂布棒均匀涂布至水样吸收入琼脂 平板中。,涂布均匀良好,涂布不均匀,五、菌落计数及报告方法p208,（一）平板菌落数的选择1、进行平皿菌落计数时，记下同一浓度的2个平板（或 3个）的菌落总数，计算平均值，再乘以稀释倍数即为1ml水样中的细菌总数。2、计数时应选择菌落数在30300/皿之间的稀释倍数进行计数，若同个稀释度中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿计数该稀释度的平均菌落数。若片状菌落少于平皿的一半时，而另半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。在记下各平皿菌落数后，应算出同一稀释度的平均菌数，供下步计算时用。,(二)稀释度的选择l、首先选择平均菌落数在30300者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可用它作为平均值乘其稀释倍数。2、若有两个稀释度的平均菌落数都在30300之间，则应按两者的比值来决定。若其比值小于2，应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落数。3、如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,4、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之5、如果全部稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6、菌落计数的报告，菌落在100以内时按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字；在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数,也可用10的指数来表示，在所需报告的菌落数多至无法计算时，应注明水样的稀释倍数。,思考题,试比较平板菌落计数法和显微镜直接计数法的优缺点及应用。当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题在哪里？为什么融化后培养基要冷却至45左右才能倒平板？测定水中细菌菌落总数有什么实际意义？根据我国饮用水水质标准，讨论你这次的检验结果。,无菌操作：无风条件下，酒精灯火焰周围10cm距离。目尺不变，在不同物镜下用台尺标定血球计数板计数室美蓝染色 不同时间不同浓度的影响-揭示了什么？,视野调解,4X,10X,40X,样品,目标,4X,10X,40X,样品,实验10 滤膜法测定水中总大肠菌群,一、实验目的 了解大肠菌群的检测方法。,背景知识,大肠菌群的定义:大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在3724 h能分解乳糖产酸、产气、需氧和兼性厌的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属等。,大肠菌群=大肠杆菌吗？,大肠菌群包括大肠杆菌。大肠菌群指能够发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴型无芽孢杆菌。大肠埃希氏菌(E.coli)习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。,大肠菌群的卫生意义,大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。为什么？粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而水体或食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。为何不直接测定致病菌数量？,大肠菌群的检验比较简单，但其和粪便污染的相关性还受到质疑，原因是其中的一些细菌能够在环境样品中检出。相对来说，粪大肠菌群对粪便污染的指示作用更为直接和贴切，而且检测方法相对大肠杆菌简单，为此是一种较好的粪便指示菌（或称为“指示菌群”）。与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群的存在表明食品可能直接或间接的受到了近期的粪便污染。粪大肠菌群又叫耐热大肠菌群，主要就是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属。,题外,2 原理,滤膜是一种微孔薄膜，孔径0.450.65m，能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留至滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，算出每升水样中含有的总大肠菌群数伊红美蓝琼脂含有伊红和美蓝两种苯胺类染料，它们可以抑制革兰氏阳性菌的生长。同时，这些染料可以区分那些发酵乳糖的微生物。大肠菌群因其强烈发酵乳糖而产生大量的混合酸，使菌体表面带上正电荷，可染上伊红染料，伊红与美蓝结合，菌体被着上深紫色，在含有两种染料呈紫色的培养基上，形成带核心、具金属光泽的菌落。,3实验材料,滤器 6套滤膜，孔径0.450.65m。直径根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。抽滤设备3台。无齿镊子6把。高压蒸汽灭菌器。干热灭菌箱。恒温箱。95%酒精及酒精棉，用于灼伤灭菌过滤器。采样瓶、平皿（直径9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中160灭菌2h。一泓美兰琼脂,4 实验步骤,4.1 准备工作 4.1.1 水样采集滤膜灭菌：将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤23次，以除残留溶剂。配制伊红美蓝平板4.1.4 滤器灭菌：用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。也可用121灭菌20min,5.2 过滤水样,5.2.1 用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放已灭菌的滤床上，稳妥地固定好滤器，将333ml水样（如水样含菌数较多，可减少过滤水样量）注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在负压0.5大气压下抽滤。5.2.2 水样过滤完后，再抽气5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全帖紧，两者间不得有气泡，然后见平皿倒置，放在37恒温箱内培养2224h。,5.3 观察结果,5.3.1 挑选符合下列特征菌落进行记数。深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。,5.4 验证,革兰氏染色、芽孢染色、乳糖蛋白胨半固体培养基培养。,5.5 总大肠菌群的计算,1L水样中总大肠菌群数等于滤膜上生长的大肠菌群落总数乘以n。,注意事项,火焰灭菌时避免烫伤。玻璃砂芯过滤器，易碎且价格昂贵，同学使用过程中应细心、注意安全。取滤膜时，统一夹取边缘部分，以免损坏滤膜，影响过滤效果。滤膜和培养基之间不应有气泡。培养温度和时间应控制好。37，22-24h。,思考题,用滤膜法测细菌总数，该如何处理？滤膜法相对于多管发酵法的优缺点是什么？,作业点评,此次实验报告相对不理想实验简单描述现象描述数据及表格处理（抑菌圈大小）结论及分析,实验 11环境因素对微生物生长的影响,一、实验目的,1、了解温度、紫外线及常用化学消毒剂对微生物的作用；2、观察各因素对微生物生长抑制的强弱。,二、实验原理,微生物广泛地分布在自然界的各种环境中。环境中的物理因素、化学因素和生物因素对不同类型微生物的生长发育产生不同的影响，或生存、或抑制、或死亡。反之，由于微生物的生命活动对局部区域的小环境也会产生一定的影响，或产酸、或产碱、或产酶、或产生次生代谢产物，从而可以改变自然环境。由此，微生物与自然环境之间是相互影响、相互作用的矛盾统一体当环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；当环境条件的变化超过一定极限时，则导致微生物的死亡。通过人为设计的环境因素对微生物生长发育影响的试验，可以有助于理解环境条件与微生物生命活动之间的关系。,物理因素,紫外线可以引起微生物细胞核的核酸分子发生光化学反应，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶与尿嘧啶的水合物，致使核酸变性。不同的照射剂量、照射时间、照射距离可以导致菌体死亡或发生变异。因此紫外线可作为物理诱变剂来进行微生物菌种的诱变和选育工作。,化学因素,一些化学药剂对微生物生长有抑制或致死作用，因此可选择适宜的化学药剂，配制成适宜的浓度进行消毒或灭菌。,生物因素,广谱抗生素？窄谱抗生素？抗菌谱泛指一种或一类抗生素（或抗菌药物）所能抑制（或杀灭）微生物的类、属、种范围。如青霉素的抗菌谱主要包括革兰阳性菌和某些阴性球菌，链霉素的抗菌谱主要是部分革兰阴性杆菌，两者抗菌谱的覆盖面都较窄，因此属于窄谱抗生素（Narrow Spectrum Antibiotics）。而四环素类的抗菌谱覆盖面广，包括一些革兰阳性和阴性细菌，以及立克次体、支原体、衣原体等，因此为广谱（Boad Spectrum）抗生素。,三、实验器材,1、菌种 大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、同学自己的菌种2、培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板3、溶液及试剂 75%乙醇、2-4%结晶紫水溶液、0.25%新洁尔灭、氨苄青霉素100mg/ml、无菌水等。4、仪器及设备无菌小圆滤纸片若干、试管、吸管、三角涂棒、挡光物体(小于9cm)、冰箱、培养箱、无菌工作台等。,四、操作步骤,分组：6-8人一大组，每小组3个琼脂平板。（一）温度实验接种大肠杆菌或金黄葡萄球菌到牛肉膏蛋白胨平板放在4、37和50条件下培养，24h后观察。,易干燥，怎么办？,（二）紫外线杀菌实验,1、用无菌吸管吸取0.1mL培养18h的金黄色葡萄球菌菌液加入前述平板中，以无菌涂布棒将菌液涂布均匀。2、打开培养皿盖，将消毒或灭菌后的挡光物体放入培养皿中，遮住培养基的一部分，在紫外线照射30min（预热10min），取出挡光体，包好（黑纸）培养皿，在37温室中培养24h后观察。,为何？,可自选，也可使用实验