微生物发酵动力学zu.ppt

第三章 微生物发酵动力学,发酵动力学：它以化学热力学(研究反应的方向)和化学动力学(研究反应的速度)为基础，研究发酵过程中变量在活细胞作用下变化的规律，以及各种发酵条件对这些变量变化速度的影响。研究目的：有助于我们更加深入地认识和掌握发酵过程，为工业发酵的模拟、优化和控制订下良好的理论基础。研究内容：细胞生长和死亡动力学；基质消耗动力学；氧消耗动力学；二氧化碳生成动力学；产物合成和降解动力学；代谢热生成动力学。,必须注意，发酵动力学的研究对象既然是运动着的细胞，就不能单纯地用传统的静态变量如残余基质量、溶氧量、菌体量等进行描述，必然会涉及到许多动态变量，如细胞比生长率、基质比消耗率、比耗氧率、二氧化碳比释放率、产物比生产率等。这些动态变量一般不能直接测量，只能根据动力学方程式间接估计。,一、模型的简化,细胞的生长、繁殖代谢是一个复杂的生物化学过程，该过程既包括细胞内的生化反应，也包括胞内与胞外的物质交换，还包括胞外的物质传递及反应。,细胞的生长、繁殖代谢的生物化学过程体系具有多相、多组分、非线性的特点。多相指的是体系内常含有气相、液相和固相；多组分是指在培养液中有多种营养成分，有多种代谢产物产生，在细胞内也具有不同生理功能的大、中、小分子化合物；非线性指的是细胞的代谢通常需用非线性方程来描述。,同时，细胞的培养和代谢还是一个复杂的群体的生命活动，通常每1ml培养液中含有104108个细胞，每个细胞都经历着生长、成熟直至衰老的过程，同时还伴有退化、变异。因此，要对这样一个复杂的体系进行精确的描述是困难的。为了工程上的应用，首先要进行合理的简化，在简化的基础上建立过程的模型。,要简化的内容有:：微生物反应动力学是对细胞群体的动力学行为进行描述。不考虑细胞之间的差别(treat all cells as equivalent)，而是取其性质上的平均值。在此基础上建立的模型称为非分立模型(Unsegregated）。在细胞的生长过程中，细胞内各种成分视为以相同的比例增加，而且忽略环境的变化对菌体组成的影响。,1.4 模型的简化(Model Simplification),Two concepts：Equilibrium growth and unstructured model(均衡生长和非结构模型)在细胞的生长过程中，如果细胞内各种成分均以相同的比例增加，则称为均衡生长。细胞生长时胞内各组分增加的比例不同，称为非均衡生长。,细胞的组分是复杂的，有蛋白质、脂肪、核酸等，这些成分的含量大小随环境条件的变化而变化。如果是在考虑细胞组成变化的基础上建立的模型，则称为结构模型，它能从机理描述细胞的动态行为。在结构模型中，一般选取RNA、DNA、糖类及蛋白质的含量作为过程的变量，将其表示为细胞组成的函数。,但是，由于微生物反应过程极其复杂，加上检测手段的限制，缺乏可直接在线测量的传感器，给动力学研究带来了困难，致使结构模型的应用受到了限制。,如果把菌体视为单组分，则环境的变化对菌体组成的影响可被忽略，在此基础上建立的模型称为非结构模型。它是在实验研究的基础上，通过物料衡算建立起经验或者半经验的关联式。从模型的简化考虑一般采用：均衡生长的非结构模型。,一、Gaden对发酵的三分类,类型（偶联型模型）产物的合成和菌体的生长相偶联产物的形成与细胞生长呈相关的过程。产物是细胞能量代谢的结果，此时产物通常是基质的分解代谢产。例如乙醇、乳酸发酵。,x,p,第二节 发酵动力学类型,类型（混合型）产物的合成和菌体的生长部分偶联 产物的形成与细胞生长部分相关或具有间接关系，例如柠檬酸、谷氨酸发酵等。,x,p,第二节 发酵动力学类型,二、初级代谢产物和次级代谢产物,次级代谢产物：还有一类产物，对细胞的代谢功能没有明显的影响，一般是在稳定期形成，如抗生素等，这一类化合物称为次级代谢产物。,初级代谢产物：微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质。如氨基酸、核苷酸等等，这些物质称为初级代谢产物。,第二节 发酵动力学类型,类型（非偶联型）产物的合成和菌体的生长非偶联产物的形成与细胞生长不相关或无直接关系，其特点是细胞生长期基本无产物合成，细胞停止生长，产物则大量合成。属于这类的产物是次级代谢产物。例如青霉素、链霉素等抗生素发酵。,x,p,第二节 发酵动力学类型,第三节 微生物生长和分批发酵动力学,1.1 Batch Operation间歇操作（Batch Operation）又称间歇培养（Batch Culture)也称分批培养或批式培养，是指在灭菌后的培养基中，接种微生物，在一定的条件下培养微生物，直至反应结束，在培养过程中不再向培养基中加入或移去主辅物料（如果是需氧微生物，则需不断通风供氧）的培养方式。,间歇培养的最大特点：反应体系中微生物浓度和生理状态随培养时间变化，营养成分和代谢产物亦随培养时间而变化。,将细胞接入新鲜培养基后，定时取样分析细胞浓度随时间的变化，可以发现细胞的生长曲线呈明显的几个时期。,(二)四个时期1.延滞期（lag phase）其它名称：停滞期、调整期、适应期现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。特点：生长速率常数=0；细胞形态变大（长）；细胞内RNA特别是rRNA含量增高；合成代谢活跃，易产生诱导酶；对外界不良条件敏感。,原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物。影响延迟期长短的因素：菌种接种物菌龄(对数生长期)接种量(大，易形成优势)培养基成分(合成与天然培养基),2.对数期（logarithmic phase）其他名称：指数期现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。特点：生长速率常数最大;平衡生长;代谢最旺盛;对理化因素较敏感;影响因素：菌种;营养成分与浓度;培养温度;,3.稳定期（stationary phase）又称：恒定期或最高生长期特点：细胞增殖与死亡数几乎相等，细胞数达最高值；开始积累内含物或产芽孢；开始合成次生代谢产物；影响因素：限制性营养物的量；营养物的比例；有害代谢废物的积累；物化条件；,4.衰亡期（Death or decline phase）特点：出现“负生长”；细胞出现多形态变化；菌体死亡、自溶；影响因素：环境条件变化；分解代谢超过合成代谢；,About Lag Phase,在发酵工业生产中，为了提高生产效率，希望延迟期缩短，要达到该目的，应一般遵循下列规则：(1)接种的微生物应尽可能是高活力的。要用处于对数期的微生物作种子.(2)种子培养基和条件应尽可能接近生产上使用的发酵液组成和培养条件。(3)建议采用大接种量。因细胞内部的某些维生素和辅酶等生长素，向周围培养液扩散，从而降低细胞的活性，延长延迟期,About Exponential Phase,对数生长期的微生物生长速率正比于原有的微生物数，其生长动力学方程为：,About Exponential Phase,对数生长期的微生物生长速率正比于原有的微生物数，其生长动力学方程为：,若为常数，则：这就是指数生长方程。指数生长方程说明微生物细胞量的对数值与培养时间呈直线函数关系，故也称为对数生长方程.,式中比生长速率也叫生长比速，当指数生长期时,其值最大常用m表示；细胞浓度X一般用每单位体积干细胞的质量(g/L)表示；X0和X分别表示t=0和t时的细胞浓度。在对数期是常数，取得最大值，在其它生长期不是常数。,dx/dt=x,=(1/x)(dx/dt),x:细胞的浓度 g/Lt:培养时间 h,:比生长速度 h-1单位菌体浓度引起的菌体增长，反映了指数生长期细胞生长的快慢。,对数期为常数,初始条件:t0=0,t;x0,x,积分得：,6.87*1010,例1：在5 m3培养液中，按5%接种量接种，已知原接种液中含菌5106（个/毫升），如果培养后发酵液中的菌体含量需达4109（个/毫升），求所需培养时间。假定在整个培养时间，均满足s Ks的条件，已知max=0.8 h-1,解：,因为s Ks，故,所以积分得,依题意,于是,指数生长期细胞浓度增加一倍所需的时间td,也即是细胞的平均传代时间或又称为细胞的倍增时间。而由指数方程可知倍增时间tdln2/。,微生物td:0.5-5 h动物细胞td:15-100 h植物细胞td:24-74 h,td 和反映在对数生长期微生物的生长特性，,工业上也常用菌体细胞的倍增时间td来表示菌种生长活力的高低。,试证明 td=0.693/，式中td为倍增时间，为比生长速率。证明：因为td为倍增时间，而ttd时，细胞浓度x等于初始细胞浓度的2倍，即X=2X0 由指数生长方程：X=t+X0 可得，2X0=td+X0 则：td=ln2/=0.693/,例题2：,例3：某微生物的 0.125 h-1，求td。,指数生长方程,并不是所有微生物的生长速度都符合指数生长规律线形生长（碳氢化合物做营养物）立方根生长（某些丝状微生物）,About Exponential Phase,虽然以上方程由对数生长期得出，但对其它生长期也同样适用,二 微生物生长速率与底物浓度的关系（Monod)方程,微生物的生长速率受到许多因素的影响，T、pH、底物浓度等都影响微生物的生长速率。这里需要提出来讨论的是底物浓度与微生物生长速率之间的关系。在一定条件下，微生物的生长速率是底物浓度（s）的函数,Monod根据实验观察到的E.Coli的比生长速率在底物浓度低时呈一级反应动力学，在底物浓度高时呈二级反应动力学的特点，提出细胞的比生长速率与单一限制性底物之间存在下述关系：:比生长速率(h-1)max:最大比生长速率(h-1)Ks:微生物生长的饱和常数（gL）S：限制性底物浓度（gL）,什么是限制性底物？它可以是培养基中任何一种与微生物生长有关的营养物，只要该营养物相对贫乏时，就可能成为限制微生物生长的因子，可以是C源、N源、无机或有机因子。那么营养物质相对贫乏又指的是多少量呢？,是指该物质的浓度在比生长速率 达m时对应的最低底物浓度Scrit以下时的情形。Scrit称为临界底物浓度，任一营养物质的浓度若高于Scrit则为非限制性底物，低于Scrit即为限制性底物,图3-6,所以限制性底物就是在培养微生物的营养物质中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。莫顿方程表面上与米氏方程同型。但是Monod方程来自于对实验现象的总结，而米氏方程是根据酶促反应机理推导出的。前者是经验方程，后者是机理方程。,关于反应级数,一级反应：反应速率与浓度关系可以用单分子反应表示二级反应：反应速率与浓度关系可以用双分子反应表示零级反应：反应速率与反应物浓度无关,Comparison of Monod equation and M-M equation,m 最大比生长速率Ks 微生物生长饱和常数,Vm 酶的最大反应速率Ks 复合物的解离常数,Monod 研究了基质浓度与生长速度的关系Monod方程(1949),米氏方程:,图3-4,图3-5,Monod equation,MM equation,Monod方程描述的是比生长速率与底物浓度得关系；M-M方程描述的则是反应速率与底物浓度得关系；另外，Monod方程中，细胞浓度无法采用物质的量浓度单位，只能采用g/L或细胞数/L，相应的底物浓度单位也有g/L;而M-M方程可以从严格的酶催化反应机理推导得到，所有的浓度单位是mol/L。,Monod方程中的常数m和Ks同样可以用双倒数图解法得出。或 应用前一个方程图解时，可得到相当精确的m，但在低S值时的偏差较大，影响Ks值的精度。后一个方程则在实际的S值范围内有较高的精度。,max and Ks of several common microorganisms,例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：,底物浓度 S(mg/l)6 33 64 153 221比生长速率(h-1)0.06 0.24 0.43 0.66 0.70,求：在该培养条件下，大肠杆菌的max，Ks和td。,例题：,S/(mg/l.h)100 137.5 192.5 231.8 311.3 S(mg/l)6 33 64 153 221,解：将Monod方程变换形式：,数据整理如下：,max，1.11(h-1);Ks97.6 mg/L,tdln2/max0.64 h,某种微生物在某种基质条件下m和Ks为一定值；同一种微生物在不同基质情况下有不同的m和Ks值，一般m变化不大，而Ks则变化较大；Ks大小反映了菌体对基质的亲和力强弱，Ks越大，亲和力越小，二者表现出相反关系。,典型的ks值很小，实验时用的底物浓度很小，这样低的s值，又要快速测出它的变化量，那就要采用极为灵敏的、准确的测定底物和菌体浓度的方法，才能通过测定间歇培养的初速度反应来测定ks值,Lag Phase x无净生长 0 加速生长期 x增加 21Exponential Phase x对数增加 常数 减速生长期 x增加缓慢 43Stationary Phase x无净生长 0 Death Phase x减少 0,Monod方程适用于许多微生物生长过程，但是因该方程表述简单，有的时候不足以完整地说明复杂的生化反应过程，已发现它在某些情况下与实验结果不符，因此人们又提出了另外一些方程来描述微生物的生长。如Powell提出的：考虑到细胞壁的渗透性和基质的扩散性，引入KD 扩散阻力因子,此方程适合于高密度下细胞生长，方程中KS与细胞密度相乘。,此方程考虑到细胞壁的渗透性和基质的扩散性，引入KD扩散阻力因子。,3.3 Multiple Substrate Model,（由于并非所有的培养体系中细胞生长都只有一个限制性底物。在不少情况下，往往有多种底物同时影响细胞比生长速率，且底物对生长的影响也是多样的)。,（有时几种底物都是细胞生长所必需的营养物质，并且它们同时作为细胞生长的限制性底物）。,有些底物之间可以相互替代并同时被利用，只要这些底物中一种被利用，细胞就能正常生长，而当其他底物也被利用时，细胞的比生长速率将进一步提高）。有时几种底物按照一定先后次序被利用，也就是说，一些底物比另一些底物会优先进入细胞的代谢途径中被利用。,针对出现上述几种情况的原因，主要是与细胞的代谢组成和相应的酶合成的控制等诸多因素有关。由于多底物对细胞生长影响的复杂性，使得单一限制性底物的非结构模型（Monod模型）不再适用。,3.4 Substrate inhibition kinetics,由于各种原因，细胞的生长有时会受到底物的抑制。由于细胞生长本质上是一系列酶催化反应过程，其中的个别酶可能对整个反应过程起着限速作用，而细胞生长的总比生长速率取决于限速步骤的酶反应。因此可采用与酶催化反应类似方法，对Monod模型作一定的修饰来描述底物抑制现象。,有研究表明，如果初始底物浓度（Cs0）过高，细胞的比生长速率（）会降低（这一点不同于Monod 方程中的表述）。其可能的原因是因底物浓度过高，导致培养体系的渗透压和离子强度变大，使物质的跨膜运输体系受到抑制，或者某些在低底物浓度时不容易积累的抑制性副产物，在高底物浓度下出现大量积累。,针对上述现象，也可通过对Monod模型作一定的修饰，得到下述表达式，并进行解释：式中，S0底物初始浓度，KS0为无量纲初始饱和常数。根据修饰后的这个模型，可以看出当初始底物浓度S0很高时，细胞的比生长速率会显著降低。,另外,底物对细胞生长的抑制与酶反应一样，也有反竞争性抑制和非竞争性抑制现象。对于底物的反竞争性抑制现象来说，细胞的比生长速率与底物浓度间的关系可表示为：,式中，Ks为饱和常数;KI为抑制常数,对于底物的非竞争性抑制现象来说，细胞的比生长速率与底物浓度间的关系可表示为：,对葡萄糖，无机盐等常见底物而言，通常只有在较高的底物浓度下才会发生底物抑制，也即培养基中某种基质的浓度高到一定程度后，细胞生长出现底物抑制现象，此时抑制常数KI饱和常数Ks。,根据上述两式，可知，当存在底物抑制时，随着底物浓度的增大，细胞的比生长速率将先增大后减小，其间存在一个极大值。,对上式进行两边求导（d/dS0），求得比生长速率最大时所对应的底物浓度为：,第四节 微生物反应过程的计量学,化学计量学是对化学反应体系的组成和化学反应转化程度的数量化研究。A+B=C+D 元素平衡法 根据化学计量学，可知反应过程中反应组分的数量关系。研究化学计量学的目的是对反应过程进行控制和优化，争取获得最大的经济收益。,第四节 微生物反应过程的计量学,反应工程学 反应热力学 反应动力学,第四节微生物反应过程的计量学,微生物反应过程的计量学：碳源（多种）+氮源（多种）+无机盐（多种）+有机生长因子（多种）+水+氧气=细胞+主产物+副产物（多种）+二氧化碳对于微生物反应过程，由于参加反应的组分多，代谢途径错综复杂，同时，微生物在生长，并且微生物菌体也不能用摩尔摩尔的对应关系表示其计量关系，所以要用元素平衡的方法对微生物反应进行计量，将是十分复杂和困难的,第四节 微生物反应过程的计量学,工程上又不能回避计量问题，每一个工业化的生物反应过程都需要计量。人们提出了一个非常简单的方法，就是引入得率系数（Yield coefficients）的概念，作为描述微生物反应中计量关系的宏观参数。,分批培养时微生物细胞的生长与产物形成的动力学,培养基中的营养物质被微生物细胞所利用,生成细胞：细胞得率系数,生成代谢产物：产物得率系数,消耗一克营养物质生成的细胞的克数或生成的产物的克数,工业上，一段时间的平均值，获得为表观得率系数,生长得率系数有以下几种定义 1、对基质的细胞得率Yx/s(Monod提出）在分批培养时，培养基的组分在不断变化，因此在培养过程中细胞得率系数不能视为常数，在某一瞬时的细胞得率称为微分细胞得率。分批培养过程，总的细胞得率为,表示每消耗1 mol O2所能形成的菌体质量（克），即：In formula,O2氧的浓度（oxygen concentration）(unit:mol/L);O2氧浓度的变化量（change of oxygen concentration）(unit:mol/L).,Yx/Kal是一种用能量基准表示菌体繁殖收率的方法，单位为g菌体/kal,可按下式计算：,(2)与代谢过程有关的得率系数Yields of related with metabolic processYX/Ave-表示基质完全氧化时，由一个电子转移所引起的菌体繁殖量，是又一种能量基准表示菌体繁殖收率的方法。单位为g菌体/Ave-式中，Ave表示有效电子数，它是微生物利用基质（碳源）的氧化反应过程中所实际转移的电子数。,YX/C、YX/P、YX/N分别表示消耗1mol碳、1mol磷、1mol氮所生成的菌体细胞的质量（克）。考虑碳源基质时，无论是需氧(aerobic)还是厌氧(anaerobic)培养，宏观上碳源的一部分被同化为细胞组成物质，其余部分分别被异化、分解为二氧化碳及其它代谢产物。,为了表示由碳源同化为细胞组成物质过程的转化效益，采用对碳的细胞得率Yx/c。Yx/c一般在左右的范围内。,第四节微生物反应过程的计量学,3、对ATP生成的细胞得率YX/ATP 细胞通过基质的氧化而获得细胞合成、物质代谢、物质传递过程等生命活动所必需的能量。但是它并不是利用了基质氧化的全部能量，而只有在氧化反应中以生成ATP形式获得的自由能，被微生物生命活动所利用，其余部分作为反应热释放到环境中。据此，ATP的生成量和细胞生长量有关联，以异化代谢过程中ATP的生成量作为细胞得率的基准。YATP表示为：,(3)与能量代谢有关Yield of related with energy metabolism:细胞通过基质的氧化而获得细胞合成、物质代谢、物质传递过程等生命活动所必需的能量。但是它并不是利用了基质氧化的全部能量，而只有在氧化反应中以生成ATP形式获得的自由能，被微生物生命活动所利用，其余部分作为反应热释放到环境中。,由于ATP的生成量和细胞生长量有关联，因此，以分解代谢过程中ATP的生成量作为细胞得率的基准。YX/ATP表示每生成1molATP所能形成的菌体量，单位为g菌体/mol ATP。,MS为底物的相对分子质量,一般YX/ATP要优于YX/S，因为细胞的生长直接与细胞从分解代谢中获得的能量（即ATP的生成）成正比。通常，YX/ATP不是固定不变的，变化范围在6-29之间，单位为g菌体/mol ATP。根据大量实验发现，在厌氧培养时，YX/ATP值与微生物、基质的种类无关，基本上为常数，YX/ATP=10，单位为g菌体/mol ATP。,(4)生长得率的可变性 生长得率系数虽定义为特定菌株与特定基质之间的关系，但实际发酵中，还取决于培养基中所有其它成分的化学性质和浓度，而这些成分的实际浓度又受反应器内物理现象（如混合时间tm和传氧速率OTR）的影响，可用下式表示：Y=f(菌株、基质、m、t、tm、OTR、C/N）因此，需要由实际生产、经验测定总结。,2.产物得率系数Yield of Product coefficient,与微生物细胞的生长一样，代谢产物的形成也是营养物的生物转化过程。Just like the cell growth,the formation of metabolic products is also a bioconversion process.每一个这样的转化过程，可用一个产物得率系数来定量。And each bioconversion process can specify with a yield of product coefficient.,In common use,yields of product included YP/S,YCO2/S,YATP/S and YCO2/O2 etc.In practical production process,YP/S was often used widely.In industry fermentation process，the calculation of YP/S was similar with that of YX/S.That is to say,according to the amount of product formation and substrate consumption in a certain time,the yield of YP/S was obtained：YP/S=P/S（P-P0)/(S0-S),分批培养的生产率,在评价发酵过程的成本、效率时，应利用生产率的概念。发酵过程中的生产率一般定义为每升发酵液每小时产生的细胞或产物质量(g/h.L).生产率=细胞或产物浓度/发酵时间 生产率是衡量发酵过程总成果的一种综合指标，在讨论分批培养过程时，必须考虑所有的因素，总运转时间包括发酵时间，还应包括放罐、清洗、装料和消毒的时间以及延滞期所耗费的时间。,(四)基质消耗动力学Substrate Consumption Kinetics,在间歇培养中，培养基中基质的减少是由于细胞的生长所消耗以及生成产物时的消耗。如果所有底物都消耗于细胞合成，且细胞对底物的得率系数Yx/s为常数，则可以用细胞得率系数Yx/s把基质消耗速率和细胞生长速率相关联。,式中，YX/S为细胞对底物的得率系数（g/mol)；KS细胞生长饱和常数(g/L)。,如果限制性基质既是碳源又是能源时，也即消耗掉的碳源一部分形成细胞物质，一部分形成产物，一部分产生能量供细胞维持生命活动之用。则底物消耗动力学方程为：式中，YX/S为细胞生长得率系数（g/mol)；m细胞维持系数(mol/g.s)；YP/S产物得率系数(mol/mol)。,五 产物形成动力学,一）物料平衡与比速率二）产物形成动力学模式,物料平衡与比速率,对于细胞生长、基质利用和产物形成的物料平衡方程式可分别表示如下：(1)cell growth：即：细胞积累=生长-移出-死亡 式中，Fo 移出液体积流量；V 反应器容积；死亡系数（比死亡速率），比生长速率。,（2）Substrate consumption：即：基质积累=基质进料-生长消耗-产物消耗-维持-基质移去 式中，Fo 移出液体积流量；V 反应器容积；Fi进料液体积流量；S-基质（移出）浓度；m 维持系数（g基质/g细胞h）；qp 比生产速率（g产物/g细胞 h）,维持能及维持系数m,当底物既是能源又是碳源时，底物的消耗还应包括细胞产生维持能所消耗的底物。细胞产生维持能而消耗底物的速率可表示为：rm=m x,m为维持系数。维持系数m值的大小与环境条件和细胞生长速率有关，大部分维持能用于保持细胞渗透压的恒定。,因此，增加培养基中盐的浓度会大大增加m值，如改变了环境条件，细胞会调节酶谱以适应环境，当生长条件不变或变化很小时，用于细胞物质重新合成的维持能就较低。当细胞停止生长或适应新的底物时，m值较高。维持能主要用于维持细胞的渗透压、修复DNA、RNA和其他大分子，以维持细胞的结构和生命活性。,(3)Product formation：即:产物积累=产物合成-产物移去-产物破坏 式中，Fo 移出液体积流量；V 反应器容积；P 产物浓度；k 产物破坏系数；qp 比生产速率（g产物/g细胞 h）,上述三个方程对于稳态（连续培养）和非稳态（分批培养）发酵过程均适用（但对于分批培养求解较困难）。,对于分批发酵，由于不存在中间补料和基质 的移出，则上述三个方程可简化为：,此外，若细胞没有死亡（=0），产物也没有破坏（k=0),则上述方程还可以简化。,试证明:生长和产物对基质瞬时得率系数分别为Yx/s=/qs，Yp/s=qp/qs。（已知细胞生长dX/dt=X；基质消耗qs=-1/XdS/dt；产物形成dP/dt=qpX）,例题,(1)由Yx/s定义知，瞬时得率系数Yx/s=dX/dS,已知细胞生长dX/dt=X，则dXXdt又因为基质消耗qs=-1/XdS/dt，则dSqsXdt（负号表示基质消耗）所以 Yx/s=dX/dS=xdt/qsXdt=/qs;,证明:,(2)由Yp/s定义知，瞬时得率系数Yp/s=dP/dS,已知细胞产物形成dP/dt=qpX,则dPqpXdt而基质消耗qs=-1/XdS/dt,则dSqsXdt（负号表示基质消耗）所以Yp/s=dP/dS=qpXdt/qsXdt=qp/qs,Reaction rate can be expressed by two concepts:absolute velocity(绝对速率)and specific rate(比速率)。Absolute velocity is also called rate for short（瞬时速率）which showed the change of one component in unit reaction time or reaction volume.,反应速率的定义 Reaction Rates,细胞培养过程中细胞生物量、底物浓度和产物浓度随时间的变化情况。随着时间的延长，细胞生物量逐渐增加并达最大值，此时底物消耗殆尽，产物部分积累。,(1)cell growth rate：(细胞生长速率)(2)substrate consumption rate：(基质消耗速率)(3)product formation rate：(产物形成速率)All these rates unit are:g/lh,绝对速率,比速率是单位时间内单位细胞浓度所引起的细胞生长或产物形成或底物消耗的量。Specific rate represented the change rate of different ingredients and was calculated according to unit cell concentration and unit quality.因此，比速率与细胞浓度无关，它描述的是细胞生长及其在产物合成或者物料利用中的效率。,Specific rate（比速率）,(1)Specific growth rate：（细胞生长比速率）(2)Specific substrate consumption rate：(基质消耗比速率)(3)Specific product formation rate：(产物生成比速率),xcell concentration(unit:g/L),s substrate concentration(unit:g/L),p product concentration(unit:g/L).it was obviously that specific rate was related with cell biomass,which could explained the relationship between specific rate and cell activity.The unit of specific rate was per hours(h-1).,(二)产物形成动力学Product formation kinetics,微生物细胞培养过程中，虽然有一部分是以细胞本身或其内含物作为产品，但更多的工业过程则是以释放到细胞外的代谢产物为目的产物。微生物生成的代谢产物多种多样，且代谢产物的生成动力学也远比菌体的生长动力学复杂。,根据代谢产物的生成速率与菌体生长速率之间的关系，可以将其大致分为三种不同类型（也即三种不同的发酵动力学模型）。1）生长偶联型：Growth associated products 2）非生长偶联型：Nongrowth associated products 3）部分生长偶联型（又称混合型）：Mixed growth associated products,生长偶联型合成的产物多为初级代谢产物，即通常是分解代谢的直接产物（如葡萄糖厌氧发酵产乙醇；葡萄糖酸、乳酸的生产等），代谢产物的生成与细胞的生长是同步的，也即这类代谢产物的生成速率与菌体细胞生长直接有关。,1)生长偶联型,生长偶联型的产物形成动力学方程可表示为：,式中-产物对菌体细胞的得率系数，即YP/X，单位质量细胞生成的产物量（g/g)。qP-产物的比生成速率，即单位质量细胞生成产物的速率。,产物生成速率dP/dt与和X呈正比；而产物的比生成速率qP仅与成正比。因此，应通过获得高来提高产物合成速度。,非生长偶联型产物的合成出现在菌体细胞生长停止以后（即进入次级生长阶段），且产物的生成速率与细胞的生长速率无关，但与细胞浓度X有关。习惯上把与生长无关联的产物叫次级代谢产物，大多数抗生素和微生物毒素属于此类。但是，并不是所有的次级代谢产物的合成都一定与菌体细胞生长无关联。,2)非生长偶联型,非生长偶联型产物的生成速率很难同菌体生长连系起来，因为菌体生长和产物的形成是分开的。但产物生成比速率仍可按前面有关公式计算。,非生长偶联型的产物形成动力学方程表示式：,在产物生成速率只与菌体细胞浓度X有关情况下，细胞具有控制产物形成速率的组成酶系统，此时有：与酶活力相似，可认为它表示的是每单位细胞质量所具有的产物生成的酶活力数（g产物/g细胞h）,或,对非生长偶联型产物的生成来说，菌体在生长期和产物形成期对营养的要求有差别。可适当配用快速利用和缓慢利用的营养物的比例，分别满足不同时期菌体的不同需要。生长期菌体采用快速利用碳源的方式增殖，而产物合成期菌体采用缓慢利用碳源的方式，来延迟菌体出现衰老自溶现象，延长产物的合成期，可以提高产物产量。,需要注意的是：,菌体的生长与产物的生成只有部分联系（如乳酸发酵），产物形成速率可由下式计算：此模式可通用，生长偶联型与非生长偶联型只是其极端情形，该模式更复杂的形式是将和作为变数，在分批生长的四个生长期中分别具有特定的数值。,3)部分生长偶联型（混合型）,或,对于上述三种发酵动力学模型，若将产物比生成速率qp和菌体细胞的比生长速率，同时对时间t作曲线，可得到下面的动力学关系：,/m,qp/qpm,a,b,c,t,t,t,生长偶联型,混合型,非生长偶联型,粗线：产物；细线：细胞,以上我们讨论了细胞生长、基质消耗和产物生成的动力学方程，而由这些方程构成的（微分）方程组，可以反映分批培养过程中细胞、基质和产物浓度的变化。,如果，通过实验摸清细胞生长、基质消耗和产物生成的规律，并结合实际生产经验建立包括温度、pH、DO、诱导物及其它环境因素在内的适当的微分方程组，并确定其中动力学参数的值。那么，就可以对分批培养过程进行模拟，从而借助于计算机对分批培养进行优化控制，使产物的生产效率大大提高。,第三节连续培养及其动力学 The Continuous Stirred Tank Reactor,微生物分批培养时，即使提高营养物的初始浓度，或者采用某些措施来中和、稀释对细胞有毒害的某些代谢产物，但对数生长期迟早要结束，稳定期也必将出现。就这一问题的彻底解决，Monod首先提出了连续培养方式。此培养方式为稳态过程。即:能使微生物一直处于对数生长期。,Depletion of nutrientsLack of oxygenChange in pHGrowth inhibition from metabolic end products,Why do Cells Stop Growing?,连续培养操作时，需要先进行一段时间的间歇培养，当反应器中的细胞浓度达到一定程度后（对数生长期以后），一边把新鲜营养物加入，一边把含有菌体和产物的介质从罐内流出，实现连续培养的操作。,连续培养过程中，由于新鲜培养基不断得到补充，所以不会发生营养物的枯竭；另外，连续培养过程中由于发酵液不断地取出，所以即使发酵液中含有毒害细胞的代谢产物也不会积累。只要操作得当，将可使罐内微生物始终处于旺盛的对数生长期，而不进入稳定期。,连续操作也能使罐内细胞的浓度、比生长速率以及培养环境（如T、pH等）始终保持恒定，不随培养时间而变化。因此，连续培养为研究环境对微生物的影响，以及在最优条件下研究细胞和产物的生产，开辟了一条独特的途径。,连续培养所用的反应器大体上可分为两个主要类别：一是均匀混合的生物反应器简称全混式，CSTR；二是活塞流反应器，PFR。全混式反应器即连续搅拌罐反应器，又分为恒化器（chemostat）和恒浊器（turbitostat）。恒化器：培养液中限制性营养物浓度保持恒定。恒浊器：培养液中的细胞浓度保持恒定（细胞浓度测定很困难，很少使用）。,单级恒化器,恒化器是指具有恒定化学环境的反应器。恒化标明了操作的稳定状态特征。为了描述恒化培养的动力学稳定状态，需要对培养系统进行物料衡算。,基本操作模型如图所示。物料连续地以体积流量F流入反应器，并以同样流量流出。流入物流中基质浓度为S0，菌浓度为 Xo，Xo一般为0，反应器内有很好的混合，即各点浓度一样，特点：连续培养中流加培养液与发酵罐内培养液瞬时混合均匀；流出液的浓度与发酵罐内培养液组成相同；（稳态建立的两个假设）。,V:反应器内发酵液体积(L)X:反应器内菌体浓度(g/L)So:流加发酵液中基质的浓度(g/L)S:反应器内基质的浓度(g/L)F:补料速度(L/h),单级恒化器（简单连续培养）,对微生物（Cell mass）的物料衡算,(细胞进入)-(细胞流出)+(细胞生长)-(细胞死亡)=(细胞积累速率),在稳态操作情况下可以假设：（1）x0=0，即入口仅加入基质（S0）；（2）反应器无积累，dx/dt=0,ds/dt=0；（3）生长速率远大于菌体死亡速率，由上式可以得到,D（稀释率）,补料速度与反应器体积的比值(h-1),D 为稀释速率（dilution rate)，表示反应器中物料更新程度，是连续培养中的一个重要参数。开始连续培养一段时间（大约是平均停留时间的35倍）以后，微生物反应过程进入稳态，培养液中的细胞、基质和产物浓度恒定，不再随培养时间变化，这就是恒化培养。,当反应体系达到稳态时，反应器中的细胞浓度、底物浓度和产物浓度均保持恒定，即它们对时间的导数为零（即dx/dt=0；ds/dt=0；dp/dt=0)。则对单级恒化反应器反