工业微生物的代谢调控和代谢产物.ppt

新陈代谢（metabolism）简称代谢，是推动生物一切生命活动的动力源，通常泛指发生在活细胞中的各种分解代谢（catabolism）和合成代谢（anabolism）的总和，即：,新陈代谢 分解代谢 合成代谢,微生物的代谢调控,分解代谢又称异化作用，是指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化产生简单分子、能量（一般以腺苷三磷酸即ATP形式存在）和还原力（reducing power，或称还原当量，一般用H来表示）的作用。,合成代谢又称同化作用，是指在合成酶系的催化下，由简单分子、ATP形式的能量和还原力一起，共同合成复杂的生物大分子的过程。,复杂分子（有机物）,分解代谢,合成代谢,简单小分子,ATP,H,一切生物，在其新陈代谢的本质上具有高度的统一性和明显的多样性。,根据代谢过程中产生的代谢产物对生物体的作用不同，可分为：,初级代谢,次级代谢,初级代谢：把营养物质转变成细胞的结构物质，或对机体具生理活性的物质，或为机体生长提供能量的物质的一类代谢类型。,初级代谢对生命活动是必须的，它存在于一切生物体内。,供机体进行生物合成的各种小分子前体物、单体和多聚体物质，例如丙酮酸、各种氨基酸、核苷酸等。,在能量代谢和代谢调节中起作用的各种物质，例如ATP。,初级代谢的产物称为初级代谢产物，具体包括：,次级代谢：微生物在一定的生长时期（一般是稳定生长时期），以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程。,次级代谢并不普遍存在于生物界，也不存在于整个生长时期，即次级代谢并非生命活动所必须的。但次级代谢产物对人类是很重要的，例如抗生素、生长刺激素、色素、生物碱等。,一切生命活动都是耗能反应，能量代谢就成了新陈代谢中的核心问题。,研究能量代谢的根本目的，是追踪生物体如何把外界环境中的多种形式的最初能源（primary energy sources）转换成对一切生命活动都能利用的通用能源（universal energy source）-ATP。,微生物的能量代谢,最初能源,有机物,还原态无机物,日光,化能异养微生物,化能自养微生物,光能营养微生物,通用能源,（ATP）,生物氧化的形式,脱氢,失去电子,某物质与氧结合,生物氧化的过程,递氢（或电子）,受氢（或电子）,脱氢（或电子）,化能异养微生物的生物氧化和产能,生物氧化（biological oxidation）：就是发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总称。,生物氧化的类型,无氧呼吸,发酵,呼吸,生物氧化的功能,产还原力H,产小分子中间代谢物,产能（ATP）,底物脱氢的四条途径,HMP途径,ED途径,TCA循环,link1,以葡萄糖作为生物氧化的典型底物，它在脱氢阶段主要可通过4条途径完成其脱氢反应，并伴随还原力H和能量的产生。,EMP途径,1.EMP途径（Embdem-Meyerhof-Parnas Pathway）,EMP途径又称糖酵解途径（glycolysis）或己糖二磷酸途径（hexose diphosphate pathway），是绝大多数生物所共有的一条主流代谢途径。,EMP途径的总反应式为：C6H12O62NAD+2ADP2Pi2CH3COCOOH2NADH 2H+2ATP2H2O,在其终产物中，2NADHH+在有氧条件下，可经呼吸链的氧化磷酸化反应产生6ATP；在无氧条件下，则可还原丙酮酸产生乳酸或还原丙酮酸的脱羧产物乙醛还原成乙醇。,1、EMP途径（糖酵解）,EMP途径是多种微生物所具有的代谢途径，其产能效率虽低，但其生理功能极其重要：供应ATP形式的能量和NADH2形式的还原力；是连接其他几个重要代谢途径的桥梁，包括三羧酸循环（TCA）、HMP途径和ED途径等；微生物合成提供多种中间代谢物；通过逆向反应进行多糖合成。,从微生物发酵生产的角度来看，EMP途径与乙醇、乳酸、甘油、丙酮和丁醇等的发酵生产关系密切。,2.HMP途径（hexose monophosphate pathway）,HMP途径即已糖磷酸途径、己糖磷酸支路（shunt）、戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway）、磷酸葡萄糖酸途径（phosphogluconate pathway）或WD途径（Warburg-Dickens pathway）。,HMP途径的总反应式为：6葡糖-6-磷酸12NADP+6H2O5葡糖-6-磷酸12NADPH 12H+12CO2Pi,2、HMP途径,HMP途径在微生物生命活动中有着极其重要的意义，具体表现在：供应合成原料：为核酸、核苷酸、NAD(P)+、FAD(FMN)和CoA等的生物合成提供戊糖-磷酸；途径中的赤藓糖-4-磷酸是合成芳香族、杂环族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸）的原料；产还原力：产生大量的NADPH2形式的还原力，不仅可供脂肪酸、固醇等生物合成之需，还可供通过呼吸链产生大量能量之需；,作为固定的CO2中介：是光能自养微生物和化能自养微生物固定CO2的重要中介；扩大碳源利用范围：微生物利用C3C7多种碳源提供了必要的代谢途径；连接EMP途径：通过与EMP途径的连接，微生物合成提供更多的戊糖。,从微生物发酵生产的角度来看，通过HMP途径可提供许多重要的发酵产物，例如核苷酸、氨基酸、辅酶和乳酸（异型乳酸发酵）等。,3.ED途径（Entner-Doudoroff pathway）,ED途径又称 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解途径。最早由Entner和Doudoroff两人（1952）在Pseudomonas saccharophila（嗜糖假单胞菌）中发现，故名。这是存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中的一种替代途径，为微生物所特有。,ED途径特点是葡萄糖只经过4步反应即可快速获得由EMP途径须经10步才能获得的丙酮酸。,ED途径的总反应式为：C6H12O6ADPPiNADP+NAD+2CH3COCOOHATP NADPHH+NADHH+,4.TCA循环（tricarboxylic acid cycle）,三羧酸循环又称TCA循环、Krebs循环或柠檬酸循环（citric acid cycle），这是一个广泛存在于各种生物体中的重要生物化学反应，在各种好氧微生物中普遍存在。,是指由丙酮酸经过一系列循环式反应而彻底氧化、脱羧、形成CO2、H2O和NADH2的过程。,真核微生物，TCA循环的反应在线粒体内进行，其中的大多数酶定位在线粒体的基质中；原核微生物，例如细菌中，大多数酶都存在于细胞质内。只有琥珀酸脱氢酶属于例外，它在线粒体或细菌中都是结合在膜上的。,整个TCA循环的总反应式为：丙酮酸4NAD+FADGDPPi3H2O3CO2 FADH2 GTP 4(NADHH+),TCA循环的特点有：氧虽不直接参与其中反应，但必须在有氧条件下运转（NAD+和 FAD 再生时需氧）；每分子丙酮酸可产4个NADHH+、1个FADH2 和GTP，总共相当于15个ATP，因此产能效率极高；TCA位于一切分解代谢和合成代谢中的枢纽地位，可为微生物的生物合成提供各种碳架原料，还与人类的发酵生产紧密相关。,（二）递氢和受氢,贮存在生物体内葡萄糖等有机物中的化学能，经上述的4条途径脱氢后，经过呼吸链（或称电子传递链）等方式传递，最终与氧、无机或有机氧化物等氢受体（hydrogen acceptor或receptor）相结合而释放出其中的能量。,发酵,根据递氢特点尤其是氢受体性质的不同，可把生物氧化区分成3种类型。,呼吸,无氧呼吸,生物氧化,有氧呼吸,1.呼吸作用（respiration）,微生物在降解底物的过程中，将释放出的电子交给NAD（P）+、FAD或FMN等电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程，称为呼吸作用。,（1）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）,（2）黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN）,（3）铁硫蛋白（Fe-S）,（4）泛醌（辅酶Q）,（5）细胞色素系统,递氢体或递电子体,以氧化型化合物作为最终电子受体,有氧呼吸（aerobic respiration）：,无氧呼吸（anaerobic respiration）：,以分子氧作为最终电子受体,是一种最普遍又最重要的生物氧化或产能方式，其特点是底物按常规方式脱氢后，脱下的氢（常以还原力H形式存在）经完整的呼吸链传递，最终被外源分子氧接受，产生了水并释放出ATP形式的能量。,这是一种递氢和受氢都必须在有氧条件下完成的生物氧化作用，是一种高效产能方式。,（1）好氧呼吸（aerobic respiration）,（2）无氧呼吸（anaerobic respiration）,又称厌氧呼吸，是一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物（少数为有机氧化物）的生物氧化。特点是底物按常规途径脱氢后，经部分呼吸链递氢，最终由氧化态的无机物或有机物受氢，并完成氧化磷酸化产能反应。,这是一类在无氧条件下进行的、产能效率较低的特殊呼吸。,硝酸盐呼吸（nitrate respiration）又称反硝化作用（denitrification）,硫酸盐呼吸（sulfate respiration）,硫呼吸（sulphur respiration）,铁呼吸（iron respiration）,碳酸盐呼吸（carbonate respiration）,延胡索酸呼吸（fumarate respiration）,link2,2.发酵（fermentation）（1）定义,泛指任何利用好氧或厌氧微生物来生产有用代谢产物或食品、饮料的一类生产方式。,广义的发酵,指在无氧等外源氢受体的条件下，底物脱氢后所产生的还原力H未经呼吸链传递而直接交某一内源性中间代谢物接受，以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应，即：,狭义的发酵,不同的微生物通过发酵作用，积累的代谢产物是不一样的。根据主要代谢产物将微生物发酵分为以下几个类型。,（2）微生物的发酵类型,乙醇发酵,乳酸发酵,丙酸发酵,混合酸发酵,丁二醇发酵,丁酸型发酵,乙醇发酵,酒精发酵是最古老的一种发酵，它在化工、医药及食品行业的用途广泛。,酵母菌的第一型发酵,酵母菌只有在pH3.54.5（弱酸性）和厌氧条件下才能进行正常的酒精发酵，称之为酵母菌的第一型发酵。,葡萄糖,2丙酮酸,EMP途径,丙酮酸脱羧酶,2乙醛,2CO2,乙醇脱氢酶,2乙醇,NAD+,NADH2,NADH2,NAD+,关键酶,1分子,2分子,乙醇发酵对环境条件的变化十分敏感,乙醇发酵需在厌氧条件下进行。如果变成好氧条件，乙醇形成就停止，葡萄糖分解的速度减慢巴斯德效应。,A.O2的作用,巴斯德效应产生的原因,在好氧条件下:(1)丙酮酸脱羧酶失活，丙酮酸脱氢酶系作用，进入TCA循环。(2)高含量的ATP及柠檬酸别构抑制磷酸果糖激酶活性，减慢葡萄糖酵解速度。,如果将发酵过程的pH值控制在微碱性（pH7.6左右）和厌氧条件下，酵母的乙醇发酵甘油发酵，得到的产物主要是甘油、少量的乙醇、乙酸和CO2 酵母菌的第三型发酵。,乙醇发酵所需的pH是弱酸性的，pH3.54.5。,B.pH的作用,葡萄糖,丙酮酸,EMP途径,丙酮酸脱羧酶,乙醛,CO2,磷酸甘油脱氢酶,乙醇,NAD+,NADH2,NADH2,NAD+,磷酸二羟丙酮,乙酸,3P甘油,甘油,EMP途径,NAD+,NADH2,在酵母菌的第三型发酵中没有ATP产生，所以这种发酵是在静息细胞中进行的。,乙酸的产生会降低培养基的pH值，使酵母菌的第三型发酵重新回到正常的乙醇发酵，所以，如果产品需要的是甘油，一定要控制好pH。,酵母菌在亚适量的NaHSO3（3）作用下可进行酵母菌的第二型发酵生成甘油和少量乙醇。,C.培养基成分的作用,葡萄糖,丙酮酸,EMP途径,丙酮酸脱羧酶,乙醛,CO2,磷酸甘油脱氢酶,NAD+,NADH2,NADH2,NAD+,磷酸二羟丙酮,3P甘油,甘油,EMP途径,NAD+,NADH2,复合物,NaHSO3,这里有少量的乙醇产生是为了维持菌体正常生长提供能量。,如果要利用酵母菌的第二型发酵来生产甘油，则培养基中的一定要亚适量NaHSO3（3），大量的NaHSO3对酵母有毒害作用。,酵母菌的酒精发酵（均在厌氧条件下）,第三型发酵pH7.6左右（微碱性）,第一型发酵pH3.54.5（弱酸性）,第二型发酵亚适量NaHSO3（3）,甘油、少量的乙醇、乙酸和CO2,甘油和少量乙醇,乙醇,通过酵母菌的三个类型发酵的分析，可以看出工艺条件对发酵工业的重要性。工艺条件不同，发酵的产品性质和数量不同，其他类型的发酵也是如此。,例如，味精的生产，即是谷氨酸发酵，在生产中，NH4+的浓度直接影响谷氨酸的产量。NH4+浓度过高，产生的谷氨酸进一步转变成谷氨酰胺；NH4+浓度过低，发酵产物不是谷氨酸而是它的前体酮戊二酸。,工艺条件一定要控制在最佳状态才能获得高产量！,乳酸发酵,乳酸发酵在工业上用于生产乳酸，在农业上用于青贮饲料的发酵，在食品加工业上也有广泛的应用。因此，乳酸是一种需求量很大的发酵产品。全世界每年乳酸的消费量为1315万吨，我国的乳酸生产量11000吨。,乳酸生产现在主要是化学合成，但化学合成法生产的乳酸是DL乳酸，发酵法生产的是L-乳酸。目前发酵法生产乳酸的产酸水平普遍在910，中试报道也达到1214，国外的产酸水平是18。,乳酸发酵是由乳酸菌在严格厌氧的条件下进行的。乳酸菌是耐氧型的厌氧菌，G+，无芽孢，有杆菌、球菌等。乳酸菌生长过程中需要多种生长因子，可分解葡萄糖产生大量的乳酸。,葡萄糖,2丙酮酸,EMP途径,乳酸脱氢酶,2乳酸,NAD+,NADH2,NAD+,A.同型乳酸发酵,凡葡萄糖发酵后只产生2分子乳酸的发酵，称同型乳酸发酵,葡萄糖,乙酰磷酸,PK途径,乙醛,乳酸脱氢酶,乳酸,NADH2,NAD+,3P甘油醛,NAD+,丙酮酸,乙醇,乙酸,CO2,B.异型乳酸发酵,凡葡萄糖发酵后产生乳酸、乙醇（或乙酸）和CO2等多种产物的发酵称异型乳酸发酵,这是一条在1960年代中后期才发现的双歧杆菌（Bifidobacteria）通过HMP发酵葡萄糖的新途径。,C.双歧杆菌途径,特点：2分子葡萄糖3分子乙酸2分子乳酸5分子ATP,乳酸发酵对我们食品工业和酿酒工业来说十分重要。例如，酸乳、泡菜、乳酪、酸奶油等的生产均通过乳酸发酵。甚至在香肠的制作中也需乳酸菌的参与。但在酿酒工业中乳酸菌是一重大污染菌。,以大肠杆菌为代表的一类肠道菌，例如，埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌等，发酵产物主要是甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等有机酸和CO2、H2，所以称为混合酸发酵。,产气杆菌、枯草杆菌等发酵产物主要是丁二醇，所以称之为丁二醇发酵。,混合酸发酵与丁二醇发酵,进行这类发酵的是肠道菌，不同的肠道菌具有不同的酶系来作用于丙酮酸，所以终产物是不同的。,丁酸发酵与丙酮、丁醇发酵,这类发酵是由专性厌氧菌梭状芽孢杆菌分解葡萄糖进行的。这类型发酵的终产物主要是丁酸、丙酮和丁醇。,葡萄糖,2丙酮酸,EMP途径,丙酮酸铁氧还蛋白氧化酶,2乙酰CoA,丁醛脱氢酶,NAD+,NADH2,NADH2,NAD+,丁酰CoA,丙酮,丁醛,丁醇,CO2,NADH2,NAD+,丁醇脱氢酶,丁酸,CoA转移酶,乙酸,乙酰CoA,在丙酮、丁醇生发酵过程中，pH要控制在4.5以下。,与丁酸发酵相类似的是己酸发酵，丁酰CoA经过类似脂肪酸合成途径合成己酰CoA，再生成己酸。己酸是一种香型物质，例如，白酒中大曲、特曲四溢的香气。乙酸还可作为食品添加剂。,呼吸作用与发酵作用的根本区别：,电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物，而是交给电子传递系统，逐步释放出能量后再交给最终电子受体。,二、自养微生物产ATP和产还原力,化能无机自养型微生物（无机物）光能自养型微生物（日光辐射能）,生物合成起点是建立在对氧化程度极高的CO2进行还原（即CO2的固定）的基础上。,异养微生物,生物合成起点是建立在对氧化还原水平适中的有机碳源直接利用的基础上。,分解代谢与合成代谢在生物体内是偶联进行的，它们之间的关系是对立统一的。,分解代谢和合成代谢间的联系,分解代谢的功能在于保证正常合成代谢的进行，而合成代谢又反过来为分解代谢创造了更好的条件，两者相互联系，促进了生物个体的生长繁殖和种族的繁荣发展。,分解代谢与合成代谢的关系图,中间代谢产物的重要性,如果在生物体中只进行能量代谢，则有机能源的最终结局只是产生ATP、H2O和CO2，这时便没有任何中间代谢物可供累积，因此，合成代谢也不可能正常进行。相反，如果要进行正常的合成代谢，又须抽走大量为分解代谢正常进行所必需的中间代谢物，结果也势必影响具有循环机制的分解代谢的正常运转。,联接分解代谢与合成代谢的中间代谢物有12种。,一、两用代谢途径,凡在分解代谢和合成代谢中均具有功能的代谢途径，称为两用代谢途径（amphibolic pathway）。,EMP、HMP和TCA循环等都是重要的两用途径。Eg.葡糖异生作用（gluconeogenesis）。,在两用代谢途径中，合成途径并非分解途径的完全逆转。在分解代谢与合成代谢途径的相应代谢步骤中，包含了完全不同的中间代谢物。在真核生物中，合成代谢和分解代谢一般在细胞的不同区域中分隔进行；原核生物因其细胞结构上的间隔程度低，故反应的控制主要在简单的酶分子水平上进行。,二、代谢物回补顺序,作用：当重要产能途径中的关键中间代谢物必须被大量用作生物合成的原料而抽走时，仍可保证能量代谢的正常进行。,代谢物回补顺序（anaplerotic sequence），又称代谢物补偿途径或添补途径（replenishment pathway），是指能补充两用代谢途径中因合成代谢而消耗的中间代谢物的那些反应。,不同的微生物种类或同种微生物在不同碳源下，有不同的代谢物回补顺序。与EMP途径和TCA循环有关的回补顺序约有10条。,乙醛酸循环（glyoxylate cycle）：又称乙醛酸支路（glyoxylate shunt），是TCA循环的一条回补途径，可使TCA循环不仅具有高效产能功能，而且还兼有可为许多重要生物合成反应提供有关中间代谢物的功能，Eg.草酰乙酸可合成天冬氨酸，酮戊二酸可合成谷氨酸，琥珀酸可合成叶卟啉等。,不同的微生物种类或同种微生物在不同碳源下，有不同的代谢物回补顺序。与EMP途径和TCA循环有关的回补顺序约有10条。,在乙醛酸循环中有两个关键酶它们可使丙酮酸和乙酸等化合物合成4C二羧酸，以保证微生物正常生物合成的需要。,异柠檬酸裂合酶（isocitrate lyase，ICL）,苹果酸合酶（malate synthase，MS）,乙醛酸循环的总反应式：2丙酮酸琥珀酸2CO2,乙醛酸循环中的两个关键反应：,具有乙醛酸循环的微生物，普遍是好氧菌，例如可用乙酸作唯一碳源生长的一些细菌，包括Acetobacter（醋杆菌属）、Azotobacter（固氮菌属）、E.coli、Enterobacteraerogenes（产气肠杆菌）、Paracoccusdenitrificans（脱氮副球菌）、Pseudomonasfluorescens（荧光假单胞菌）、Rhodospirillum（红螺菌属）等；真菌中的Saccharomyces（酵母属）、Aspergillusniger（黑曲霉）、Penicillium（青霉属）等。,柠檬酸发酵,一、菌种：能产生柠檬酸的菌种很多，但以霉菌为主，其中又以黑曲霉产生柠檬酸的能力较强，并能利用多种碳源，故常是生产上使用的菌种。二、发酵机理：细胞内有三羧酸循环和乙醛酸循环；柠檬酸合成酶活力较高，而乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶可被某些因素，如金属离子的缺乏，受到抑制，这有利于柠檬酸的积累。三、工艺流程：发酵液的pH值对柠檬酸生成影响很大；pH23时，发酵产物主要是柠檬酸；pH值中性或碱性时，会产生较多草酸和葡萄糖酸；可往培养基中加入亚铁氰化钾或采取育种手段改造菌种，使乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶缺失或尽量降低活性，以阻碍TCA循环的正常进行，从而增加柠檬酸的积累。,代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用,工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。人工控制代谢的手段：改变微生物遗传特性(遗传学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）；改变细胞膜透性；,工业发酵的目的大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。,在正常生理条件下,微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物,代谢的人工控制,人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行,微生物有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。微生物细胞的代谢调节方式很多，例如可调节营养物质透过细胞膜而进入细胞的能力，通过酶的定位以限制它与相应底物的接近，以及调节代谢流等。其中以调节代谢流的方式最为重要，它包括两个方面，一是“粗调”，即调节酶的合成量，二是“细调”，即调节现成酶分子的催化活力，两者往往密切配合和协调，以达到最佳调节效果。利用微生物代谢调控能力的自然缺损或通过人为方法获得突破代谢调控的变异菌株，可为发酵工业提供生产有关代谢产物的高产菌株。,微生物大致采用三种方式调节其初级代谢：,1.酶活性的调节2.酶合成的调节3.遗传控制,而为了生物工艺目标，常需要消除这些调节机制，使所需代谢产物过量生产。,一、酶活性的调节,酶活性的调节是指在酶分子水平上的一种代谢调节，它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率，包括酶活性的激活和抑制两个方面。酶活性的激活系指在分解代谢途径中，后面的反应可被较前面的中间产物所促进。酶活性的抑制主要是反馈抑制，它主要表现在某代谢途径的末端产物（即终产物）过量时，这个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。,（一）、激活,激活：在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。代谢调节的激活作用：主要是指代谢物对酶的激活。前（体）馈激活，指代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代谢中间产物的反馈激活，指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用,酶活性的调节,1、反馈抑制的类型,（1）直线式代谢途径中的反馈抑制,（二）、反馈抑制,（2）分支代谢途径中的反馈抑制。在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代谢途径中，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用，分支代谢的反馈调节方式有多种:同工酶调节协同反馈调节合作反馈调节累积反馈调节顺序反馈调节,同功酶调节,同功酶是指能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。其特点是：途径中第一个反应被两个不同的酶所催化，一个酶被H抑制，另一个酶被G抑制。只有当H和G同时过量才能完全阻止A转变为B。,例如，大肠杆菌以天门冬氨酸为前体合成苏氨酸(Thr)、异亮氨酸(Ileu)、甲硫氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)的代谢途径中有三种天门冬氨酸激酶的同功酶(AKI、AKII和AKIII)和两种高丝氨酸脱氢酶的同功酶(HSDHI和HSDHII)。其中AKI和HSDHI受到苏氨酸、异亮氨酸的反馈抑制和阻遏，AKII和HSDHII受甲硫氨酸的反馈抑制和阻遏；AKIII受赖氨酸的反馈抑制和阻遏。,协同反馈抑制：指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。,E或G单独一种产物过量并不能引起抑制作用。,合作反馈抑制：又称增效反馈抑制，系指两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。,累积反馈抑制：每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时，它们的抑制作用是累积的。,例如，大肠杆菌谷氨酰胺合成酶(GS)活性的调节是一个典型的累积反馈调节的例子。谷氨酰胺由谷氨酸、铵和ATP合成。谷氨酰胺中的酰胺基是色氨酸、组氨酸、氨基甲酰磷酸、6-磷酸葡萄糖胺、CTP、AMP、GMP等化合物生物合成过程中的氮源。谷氨酰胺合成酶被谷氨酰胺代谢的每种末端产物以及丙氨酸和甘氨酸所累积抑制。谷氨酰胺合成酶对这些抑制物中的每一种末端产物均有特异的结合部位。当上述8种末端产物同时过量都与酶结合时，谷氨酰胺合成酶的活性将受到最大的抑制。,顺序反馈抑制：当E过多时，可抑制CD，这时由于C的浓度过大而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一末端产物G浓度的增高。由于G过多就抑制了CF，结果造成C的浓度进一步增高。C过多又对AB间的酶发生抑制，从而达到了反馈抑制的效果。这种通过逐步有顺序的方式达到的调节，称为顺序反馈抑制,例如，枯草杆菌在芳香族氨基酸合成中，色氨酸(Try)抑制邻氨基苯甲酸合成酶(AS)，苯丙氨酸(Phe)抑制预苯酸脱水酶(PT)，酪氨酸(Tyr)抑制预苯酸脱氢酶(PD)，预苯酸和分支酸又部分地抑制7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶(DS)。,PEP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：4-磷酸赤藓糖；DAHP：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸；CA：分支酸；Per：预苯酸；AA：邻氨基苯甲酸；HPPA：对羟基苯丙酮酸；PPA：苯丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Try：色氨酸；Phe：苯丙氨酸；I：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶；II：邻氨基苯甲酸合成酶；III：分支酸变位酶；IV：预苯酸脱氢酶；V：预苯酸脱水酶,二、酶合成的调节,酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导。能阻碍酶生物合成的现象，则称为阻遏。,与上述调节酶活性的反馈抑制等相比，调节酶的合成（即产酶量）而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式。其优点则是通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。在正常代谢途径中，酶活性调节和酶合成调节两者是同时存在且密切配合、协调进行的。,（一）酶合成调节的类型,1诱导根据酶的生成是否与环境中所存在的该酶底物或其有关物的关系，可把酶划分成组成酶和诱导酶两类。组成酶是细胞固有的酶类，其合成是在相应的基因控制下进行的，它不因分解底物或其结构类似物的存在而受影响。诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。诱导物能促进诱导酶产生的物质称为诱导物，它可以是该酶的底物，也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物质。,酶的诱导合成类型,同时诱导，即当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。例如，将乳糖加入到Ecoli培养基中后，即可同时诱导出-半乳糖苷透性酶、-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成；顺序诱导，即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。,2阻遏 在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，除可用前述的反馈抑制的方式来抑制该途径中关键酶的活性以减少末端产物的生成外，还可通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。阻遏的类型主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种。,（1）末端产物阻遏,指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。对直线式反应途径来说，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏。,对分支代谢途径来说，情况就较复杂。每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏，此即称多价阻遏作用。末端产物阻遏在代谢调节中有着重要的作用，它可保证细胞内各种物质维持适当的浓度。,（2）分解代谢物阻遏,指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。因此，分解代谢物的阻遏作用，就是指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。,葡萄糖效应？,（二）酶合成调节的机制,（1）操纵子:指的是一组功能上相关的基因，它是由启动基因、操纵基因和结构基因三部分组成。启动基因是一种能被依赖于DNA的RNA多聚酶所识别的碱基顺序，它既是RNA多聚酶的结合部位，也是转录的起始点；操纵基因是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与阻遏物（一种调节蛋白）相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行；结构基因则是决定某一多肽的DNA模板，可根据其上的碱基顺序转录出对应的mRNA，然后再可通过核糖体而转译出相应的酶。一个操纵子的转录，就合成了一个mRNA分子。,（2）调节基因：用于编码组成型调节蛋白的基因。调节基因一般位于相应操纵子的附近。（3）效应物：是一类低分子量的信号物质（如糖类及其衍生物、氨基酸和核苷酸等），包括诱导物和辅阻遏物两种，它们可与调节蛋白相结合以使后者发生变构作用，并进一步提高或降低与操纵基因的结合能力。（4）调节蛋白：是一类变构蛋白，它有两个特殊位点，其一可与操纵基因结合，另一可与效应物相结合。,有的调节蛋白在其变构后可提高与操纵基因的结合能力，有的则会降低其结合能力。调节蛋白可分两种，其一称阻遏物，它能在没有诱导物（效应物的一种）时与操纵基因相结合；另一则称阻遏物蛋白，它只能在辅阻遏物（效应物的另一种）存在时才能与操纵基因相结合。,操纵子分两类:一类是诱导型操纵子，只有当存在诱导物（一种效应物）时，其转录频率才最高，并随之转译出大量诱导酶，出现诱导现象。另一类是阻遏型操纵子，只有当缺乏辅阻遏物（一种效应物）时，其转录频率才最高。由阻遏型操纵子所编码的酶的合成，只有通过去阻遏作用才能起动。,负调节,正调节,代谢调控在发酵工业中的应用,（一）应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节在直线式的合成途径中，营养缺陷型突变株只能累积中间代谢物而不能累积最终代谢物。但在分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可以使某一分支途径的末端产物得到累积。,赖氨酸发酵：工业上选育了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型菌株作为赖氨酸的发酵菌种。（高丝氨酸脱氢酶）,（二）应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节 抗反馈调节突变菌株，就是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型菌株，或兼而有之的菌株。在这类菌株中，因其反馈抑制或阻遏已解除，或是反馈抑制和阻遏已同时解除，所以能分泌大量的末端代谢产物。,赖氨酸发酵：工业上选育了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型菌株作为赖氨酸的发酵菌种。（高丝氨酸脱氢酶）,选育抗赖氨酸结构类似物突变株和抗苏氨酸结构类似物突变株，解除赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。,酶活性的调节,代谢调节部位 1.控制营养物质透过细胞膜进入细胞 2.通过酶的定位控制酶与底物的接触 3.控制代谢物流向,酶合成的调节,通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，是基因水平上的调节，属于粗放的调节，间接而缓慢。一、诱导作用（一）酶合成调节的类型1.诱导(induction)：是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。微生物通过诱导作用而产生的酶称为诱导酶（为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的酶类）。组成酶（固有酶）：不依赖底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：EMP途径的一些酶。,当微生物在含有两种能够分解底物的培养基中生长时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶的合成的现象。最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的培养基时,故又称葡萄糖效应。分解代谢物阻遏导致出现“二次生长（diauxic growth）”.直接作用者是优先利用的碳源的中间代谢物实质是：因代谢反应链中某些中间代谢物或末端代谢物的过量积累而阻遏代谢中一些酶的合成的现象。,二、分解代谢物阻遏,三、反馈调节,反馈：指反应链中某些中间代谢产物或终产物对该途径关键酶活性的影响。凡使反应速度加快的称正反馈；凡使反应速度减慢的称负反馈（反馈抑制）；反馈阻遏影响从支点到终点的酶。反馈抑制主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除。,微生物初级级代谢与次级代谢产物,初级代谢：,微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所必需的物质和能量的过程，称为初级代谢。,某些生物为了避免在初级代谢过程某种中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。可以认为是某些生物在一定条件下通过突变获得的一种适应生存的方式。通过次级代谢合成的产物通常称为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等类型。,次级代谢：,次级代谢产物及其特征,(1)次级代谢产物是由微生物产生的，不参与微生物的生长和繁殖(2)次级代谢产物的生物合成最少也要有一部分是不参与次级代谢产物生物合成的遗传物质(质粒plasmid)，但参与与质粒有关的代谢途径。(3)它的生产大多数是基于菌种的特异性来完成的。,(4)次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期和生产期。如在菌体活跃增殖阶段几乎不产生抗生素。接种一定时间后细胞停止生长，进入到恒定期才开始活跃地合成抗生素，称为生产期。(5)一般都同时产生结构上相类似的多种副组分。(6)生产能力受微量金属离子(Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+等)和磷酸盐等无机离子的影响。,(7)在多数情况下，增加前体是有效的。(8)次级代谢酶的特异性不一定比初级代谢酶高，次级代谢酶的底物特异性在某种程度上说是比较广的。因此，如果供给与底物结构类似的物质，则可以得到与天然物不同的次级代谢产物。(9)培养温度过高或菌种移植次数过多，会使抗生素的生产能力下降，其原因可能是参与抗生素合成的菌种的质粒脱落之故。,（10）次级代谢在其一个系列当中与一个酶相对应的底物和产 物也可以成为其他酶的底物。也就是说，在代谢过程中不一定非按每个阶段正确的顺序，一个生产物可由多种中间体和途径来取得，因此也可通过所谓“代谢纲目”或叫“代谢格子”这一系列途径来完成。总之，微生物次级代谢，其目的产物的生物合成途径取决于微生物的培养条件和菌种的特异性。,初级代谢与初级代谢的关系：,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,(3)、同微生物生长过程的关系明显不同,初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长过程呈平行关系；次级代谢则是在机体生长的一定时期内（通常是微生物的对数生长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同的时期。,微生物次级代谢与初级代谢及生物合成抗生素的关系,1从菌体生化代谢方面分析 许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切关系的。糖代谢中间体，既可用来合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物，这种中间体叫做分支中间体。,2、遗传代谢方面分析 初级代谢与次级代谢同样都受到核内DNA的调节控制，而次级代谢产物还受到与初级代谢产物生物合成无关的遗传物质的控制，即受核内遗传物质(染色体遗传物质)和核外遗传物质(质粒)的控制。有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物。由于这类物质的形成直接或间接受质粒遗传物质的控制，因而产生了质粒遗传的观点。也有只由染色体DNA控制的抗生素产物。,三、抗生素产生菌的主要代谢调节机