工业微生物基因育种.ppt

第五章 工业微生物基因育种,王陶 2012年2月,目的与要求,了解和掌握基因工程育种的原理与方法；了解基因工程的主要载体与基因定位诱变的原理与方法。,教学重点：质粒的特性与基因工程操作原理教学难点：基因定位诱变的原理,教学内容,1、概述 基因工程在微生物育种中的地位和作用，原理2、基因工程载体 几种常见的载体3、基因工程所用的酶 限制性内切酶，核酸酶，连接酶，聚合酶等4、基因工程的主要步骤5、基因定位诱变,一、基因工程概述,多利和它的孩子,沃尔小组成功克隆两只恒河猴,吴明杰小组：5只克 隆猪,基因操作，是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上、于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。它的创立和发展，直接依赖于基因工程或称分子生物学的进步，两者之间有着密不可分的联系。基因的研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础，基因工程的诞生是基因研究发展的必然结果；而基因工程技术的发展和应用，又深刻并有力地影响着基因的研究，使我们对基因的研究提到了空前的高度。因此，对基因研究发展的过程，以及基因的现代概念进行一下回顾是十分必要的。,基因工程与基因,基 因（gene）一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。,A brief history of genetics.,1866年，孟德尔（G.J.Mendel）提出了遗传因子（hereditary factor）的概念。他将控制豌豆性状的遗传因素称之为遗传因子形成了基因的雏形。,豌豆杂交操作,孟德尔研究的七对性状,孟德尔分离律,孟德尔自由组合律,黄圆 绿圆 黄皱 绿皱,1909年，丹麦的遗传学家W.Johanssen根据希腊语“给予生命”之义，创造了“gene”一词。但它只是一个抽象的单位，并不代表物质实体。,同源染色体分别带着控制,同一性状的两个等位基因,显性等位基因 纯合子,隐性等位基因 纯合子,杂合子,1910年，美国遗传学家摩尔根（T.H.M.organ）以果蝇为研究材料，发现了连锁交换定律并提出遗传粒子学说，第一次将代表某一特定性状的基因与某一特定的染色体联系起来，即基因位于染色体上。,野生果蝇没有现成的成对性状 摩根在长期饲养中找到各个性状的突变株。,控制不同性状的等位基因,在2#染色体上的位置,触须 长/短,身体 灰/黑,眼睛 红/紫,翅 长/短,1944年，美国微生物学家首次证实遗传物质的基础是DNA，基因位于DNA上。,The transforming principle is DNA.,DNA is the genetic material,35S 标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞,32P 标记 DNA,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞,1953年，J.Watson和F.Crike创立DNA双螺旋模型，证实基因是具有一定遗传效应的DNA片段。,1955年，Benzer在T4噬菌体的顺反互补实验中，正式使用“顺反子（cristron）”这个术语，并将顺反子与基因在意义上和功能上统一起来。同时证实了基因不是最小单位。它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，只有其中某一特定的核苷酸区段才是基因的编码区。,1960年，F.Jacob和J.Monmd提出了操纵元（操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达调控的重要规律。,基因的现代概念移动基因（movable gene）断裂基因（split gene）假基因（pseudogene）重复基因（repeated genes）重叠基因（overlapping genes）或嵌套基因（nested genes）,基因的特点:不同基因具有相同的物质基础 在原则上，所有生物的DNA都是可以重组互换的，因为地球上的一切生物，无论是高等还是低等，他们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片断，而所有生物的DNA结构都是一样的。有些病毒的基因定位在RNA上，但这些病毒RNA可以通过反转录产生CDNA，并不影响不同基因的重组互换。,基因是可以切割的 基因在染色体上的存在形式是直线排列。大多数基因彼此之间存在这间隔，少数基因是重叠排列的。,基因是可以转移的 生物体内有的基因是可以在染色体上移动的，甚至可以在不同的染色体上跳跃，插入到靶DNA分子中。基因在转移的过程中就完成了基因间的重组。（转座子、反转座子）,多肽与基因之间存在对应关系 现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。,多肽与基因之间存在对应关系 现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。,基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代 经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。,目前世界许多国家将生物技术，信息技术和新材料技术作为三大重中之重技术，而生物技术可以分为传统生物技术，工业生物发酵技术和现代生物技术。现在人们常说的生物技术实际上就是现代生物技术。现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技术。其中基因工程技术是现代生物技术的核心技术。,基因工程（genetic engineering）也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。,技术基础 20世纪60年代末70年代初，限制性内切酶和DNA连接酶等的发现，使DNA分子进行体外切割和连接成为可能。70年代中期，DNA分子的核苷酸序列分析技术问世。这两项技术，使DNA的结构分析问题得到了根本的解决。1972年首次构建了一个重组DNA分子，并提出了体外重组的DNA分子进入宿主细胞的过程，以及在其中进行复制和有效表达等问题。在60年代还发展出了琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交技术，这对于DNA片断的分离、检测十分有用，并很快被应用于基因操作实验。,基因工程研究的主要内容或步骤,从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,基因工程流程示意图,基因工程的应用 基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。,在医学上的应用 基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质肽类药物。,转基因动物和植物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。转基因植物亦已在大田中广为播,工程菌在环境工程中应用 美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。,喷洒工程菌清除石油污染,二、基因工程在微生物育种中的应用,1,提高代谢产物产量:例如所有的氨基酸合成酶基因都可以在不同系统中克隆与表达.其中苏氨酸,色氨酸,脯氨酸和组氨酸等工程菌已达到工业化生产水平.苏氨酸工程菌在前苏联和日本都已用于工业生产,苏氨酸产量可达60g/L以上,我国苏氨酸产量可达20g/L.,2,生产新的抗菌素 天蓝链霉菌合成蓝色的多酮肽抗菌素-放线紫红素,麦迪霉素产生菌合成褐色的麦迪霉素.经过两级克隆,麦迪霉素产生菌产生一种新的紫色化合物,是麦迪霉素与放线紫红素的杂种化合物,为一种新的抗菌素,命名为MederhodinA.,3,改良工业酶生产菌株:蛋白酶,木糖异构酶,纤维素酶,葡萄糖淀粉酶以及凝乳酶等均进行了研究.研究较多的是-淀粉酶和青霉素酰化酶.1981年起,在枯草杆菌或大肠杆菌中克隆和表达了来自枯草杆菌,淀粉液化芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等菌种的-淀粉酶基因,比野生株最高的可达30倍.目前美国已用基因工程菌生产.德国首先克隆大肠杆菌青霉素G酰化酶基因.我国青霉素G酰化酶的产量可达3000单位/L以上.,三、基因工程原理和步骤,一),目的基因的取得:选择适宜的给体细胞,从中采集分离有生产意义的目的基因;通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA);用化学方法合成特定功能的基因.,二),选择载体:原核受体细胞的载体,主要是细菌质粒(松弛型)和噬菌体.动物细胞,主要是SV40病毒.植物细胞主要是TI质粒,三),目的基因与载体DNA的体外重组:采用限制性内切酶处理目的基因与载体DNA,获得互补粘性末端或人工合成粘性末端.把两者放在较低的温度(56)下混合退火.由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段和粘性未端有相同的核苷酸组分,所以当两者相混时,凡粘性末端上碱基互补的片段,就会因氢键的作用而彼此吸引,重新形成双链,这时,在外加连接酶的作用下,供体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被缝合,形成一个完整的有复制能力的环状重组体嵌合体.,四),重组载体引入受体细胞:微生物,动物或植物细胞.使用最广泛的是E.coli.其次为枯草杆菌和酿酒酵母.以重组质粒作载体,用转化方法;以病毒DNA作重组载体,用感染方法.理想情况,重组载体进入受体细胞,通过自主复制而大量扩增,使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状,受体细胞就成为工程菌.,四、基因工程载体,载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：,1、分子较小，可携带比较大的片段。2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS）。4、有适合的标记，易于选择。5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。,载体,功能克隆载体（cloning vector）:克隆一个基因或DNA片断表达载体（expression vector）:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中,载 体,来源：质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体,载体的种类和特征,质粒（plasmid）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。,质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常 有1 3个抗药 性基因，以利于 筛选。,质粒载体,克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。,一、质粒的生物学特性：1、质粒DNA的构型：SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型 开环DNA（ocDNA）L 型 线性DNA（cDNA）2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：106108D 3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点,L,OC,SC,4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等5、质粒DNA的类型：接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌 素抗性基因的R质粒；F因子和F因子等。,6、质粒DNA的复制类型：低拷贝的质粒（13）：严紧型复制控制的质粒（接合型）高拷贝的质粒（1060）：松弛型复制控制的质粒（非接合型）7、质粒的不亲合性 在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性。是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。,（二）、质粒DNA的分离与纯化 1、氯化铯密度梯度离心法；2、碱变性法；3、微量碱变性法。,1.氯化铯密度梯度离心法 1、质粒DNA占总DNA的1%2%；2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。,流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中去。在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。,2.碱变性法：根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在PH值12.012.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA,（三）、质粒载体的构建与类型 1.天然质粒：没有经过以基因克隆为目标 的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个EcoR酶切位点，一个四环素抗性选择记号（Tetr），插入外源片断后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。,ColE1质粒在其唯一的单切割位点EcoRl中克隆外源DNA片断后，可根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。,2.质粒载体必须具备的基本条件(1)、具有复制起点；自我增值的基本条件，一般具一个复制子。(2)、具有抗菌素抗性；理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。(3)、具有若干限制酶切单一位点（CMS）；(4)、具有较小的分子量和较高的拷贝数。低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断 后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因,以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。,（4363bp）,3.质粒载体的选择记号 新陈代谢特性；对大肠杆菌素E1的免疫性；抗菌素抗性；四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因；抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。,4.不同类型的质粒载体高拷贝的质粒载体克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因低拷贝的质粒载体 有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。,(1)失控的质粒载体 复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。Example：pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过35度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续23小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNA占细胞总DNA的50%。,(2)插入失活型质粒载体 将外源DNA片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。Example：在pBR329质粒载体的EcoR1位点插入外源片断，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片断的重组体质粒的几率会显著上升。,(3)正选择的质粒载体正向选择：应用只有突变体或重组体才能 正常生长的培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选择记号 并可 赋予寄主细胞相应的表型。,Example：质粒pKN80有来自Mu噬菌体DNA的EcoR1-C的片断，编码一种致死功能的kil基因。该质粒在Mu噬菌体的溶源菌株中正常复制；在非溶源菌株中是致死的。在Hind 或Hpa 位点插入外源DNA片断后，会产生具Ampr表型的Mu噬菌体的非溶源的转化子菌株。,（四）、重要的大肠杆菌质粒载体 1、pSC101质粒载体；2、ColE 质粒载体；3、pBR322质粒载体；4、pUC质粒载体；5.其它的重要的质粒载体,1.pSC101质粒载体 一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有12个拷贝；分子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr）。有Hind、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、Sma 7种核酸内切限制酶。其中在Hind、BamH、Sma 3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr 基因失活。是第一个真核生物的克隆载体。,（1）应用pSC101质粒作基因克隆载体 葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达 金黄色葡萄球菌的质粒p1258,编码若干种能 在大肠杆菌检测的结构基因；能被核酸限制酶 EcoR 切割成4段。,（2）应用pSC101质粒作基因克隆载体 在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA 用核酸内切酶EcoR 消化非洲爪蟾的核糖体DNA（rDNA），与EcoR 消化的pSC101质粒进行重组。在挑取的55个转化子中，经 EcoR 酶切，电泳后13个转化子含有外源片断。转化率23.6,3.pBR322质粒载体“P”表示是一种质粒；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。,pBR322的构建：为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）,pBR322的结构来源,pBR322质粒载体的优点：1、具有较小的分子量；它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，,Example:a.在pBR322质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。,b.在Pst或Sca识别位点插入外源片断会导致Ampr基因的失活，产生AmpsTetr表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr表型的细胞可以合成 内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素 内酰胺酶Ampr的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps菌落无此反应。,3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累10003000个拷贝。,pBR322质粒载体的改良 为了更加实用，人们对pBR322质粒进行了改良，得到许多pBR322质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。,应用pBR322质粒作为基因克隆载体 水稻叶绿体光诱导基因psbA的结构分析 基因psbA编码的蛋白质，与光合作用系统相关，并且它能与除草剂阿特拉津结合，它的第264位氨基酸发生取代反应，由丝氨酸变为甘氨酸，可导致其失去与除草剂阿特拉津结合的能力，推测是三维结构发生了改变；在原生生物衣藻、蓝色细菌中，此蛋白质在同一位置由丝氨酸变为丙氨酸的取代反应，会使他们获得对除草剂的抗性功能。而且，非竞争条件下，对除草剂阿特拉津抗性的千里光属和苋属，干物质产量比敏感植物下降了25%和40%。,通过对基因psbA的体外操作，有可能创造出抗除草剂的或高光效的转基因植株。用pBR322质粒作为载体，成功的克隆了水稻的psbA基因。首先将水稻叶绿体DNA，用EcoR内切酶消化，经含有溴化乙锭的熔点琼脂糖电泳，回收分子大小为1.82.5kb之间的DNA片断。再与经过EcoR内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR322质粒DNA连接。然后转化给大肠杆菌，在氨苄青霉素的选择培养基上，形成Ampr转化子菌落群体。用经32p标记的玉米psdADNA探针作菌落杂交，从1000多个菌落中筛选出8个阳性克隆。,对这8个阳性克隆进行进一步的Southern分析，表明6个片断带有长度为2.2kb的编码水稻叶绿体psdA基因。实际上其中1.2kb的片断编码着水稻psdA基因的全部序列。通过dna序列分析表明与高等植物的同原性在92%，与蓝色细菌同源性75%,3.pUC质粒载体 人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。,一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；2、氨苄青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。3、大肠杆菌-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ基因；4、位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。,Ampr,ori,pUC18(3 kb),MCS(Multiple cloning sites,多科隆位点）,Lac promoter,lacZ,pUC质粒载体的形体图,pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第三，具有多克隆位点MCS区段 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。,4.其它的重要的质粒载体丧失迁移功能的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体穿梭质粒载体,（1）丧失迁移功能的质粒载体第一：拥有较高水平的拷贝数,平均每个大肠杆菌寄主细胞可达3045份;第二:失去了bom位点，即便在共存的F质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。,（2）能在体外转录克隆基因的质粒载体 pGEM-3Z是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体，总长度2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。pGEM-3Z与pUC质粒之间的主要区别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异的识别位点。,（3）穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。,早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-牛乳头瘤病毒迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体。,噬菌体载体（Bacteriophage，简称phage）,（一）、噬菌体的一般生物特性 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏；2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒；4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒,1.噬菌体的结构和其核酸类型：结构：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。,不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂；对寄主的依赖性较低。有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的A/T/C/G组成的。Example：T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）;SP01噬菌体DNA中没有T碱基，取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。,2.噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来,3.噬菌体的溶源生命周期溶源生长周期：是指在感染过程中没有产生出子代 噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成 为它的一个组成部分。现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期,温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶 源生命周期。溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶 源性细菌的过程整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体 DNA中原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的 噬菌体超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并 使之溶源化的同种噬菌体再感染。,溶源周期的主要特征：噬菌体和P1噬菌体噬菌体的特征：1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。,噬菌体P1基本特征：不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。,（二）、噬菌体载体,溶菌阶段(复制和释放),噬菌体载体的主要类型 1.插入式载体 一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的 派生载体。2.替换型载体（取代型载体）具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。3.凯伦噬菌体载体,插入式载体：噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。cI基因插入失活：如 gt10、NM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。,替换式载体 野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、EMBL 3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。换型噬菌体是使用最广泛的载体。,取代载体,2.组装.,连接,3.侵染,体外包装 噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106108/gDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103105/gDNA。噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%105%。,根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选,（三）、单链DNA噬菌体载体(M13),单链DNA噬菌体载体M13、f1、fd。优越性：1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式 的 DNA简称RFDNA；2.不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；3.单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多制约的，不存在包装限制 问题；4.容易测定外源DNA片断的插入取向；5.可产生含外源片断的单链DNA分子。,M13噬菌体载体 M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。,M13噬菌体的特点感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型（replication form DNA,RF DNA）。可以象质粒那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其的大小制约的，这一点正好与噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。,M13载体系列的优点 1.在这类载体的基因组中有一条饰变的-半乳糖苷酶基因片段（Hind片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列；2.M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。,（四）、噬菌粒载体,噬菌粒载体 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。,常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119 1.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；,5.由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；6.lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；,（五）、柯斯质粒载体,柯斯质粒载体cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。,柯斯质粒载体的特点具有噬菌体的特性；具有质粒载体的特性；具有较高容量的克隆能力；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力,（六）、其他载体酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome,YAC）细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）,人基因组十分庞大，约含4109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要,正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel)*酵母自主复制序列（ARS)*酵母着丝点(CEN)*酵母的选择标记(TRP1、URA1),YAC载体,BAC载体,五、基因工程的酶学基础,限制性核酸内切酶连接酶DNA聚合酶,（一）限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。,限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型酶,型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。分子量较大，反应需Mg+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。,型酶 1970年，和在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg+的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重组。,型酶 这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3端2426bp处切开，所以它的切割位点也是没有特异性的。,核酸内切酶作用后的断裂方式 粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。具有3-OH（Pst1），或5-OH(EcoR1)的粘性末端。Pst1 EcoR1 5CTGCAG 3 5GAATTC 3 3GACGTC 5 3CTTAAG 5,平末端 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。,同裂酶（isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Exampl