实验四DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳.ppt
实验四 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳,EcoR I Restriction Enzyme,识别序列-GAATT C-C TTAAG-,实验原理-限制性内切酶及酶切反应,BamH I Restriction Enzyme,识别序列：-GGATC C-C CTAGG-,Hind III Restriction Enzyme,识别序列：-AAGCT T-T TCGAA-,每一种限制性内切酶都有特定的反应条件：pH范围：7.58.0 缓冲液组份:Tris(三羟甲基氨基甲烷）、NaCl、MgCl2、温育温度：37,反应体系：DNA(1ug或更少)5ul 10 x Buffer 2ul Restriction Enzyme 3ul H2O 10ul Total 20ul混匀，37度保温30分钟,实验原理-琼脂糖凝胶电泳,电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。,琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。,琼脂糖,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,电泳法的优点,凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。样品用量少。设备简单。可在室温进行。操作简便，费时不多不同类型的电泳，有不同的用途。改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩率。,1、TAE电泳缓冲液 Tris-base 冰醋酸 EDTA2、琼脂糖凝胶（0.8%）琼脂糖：0.8g TAE：100ml,试剂,3、溴化乙锭(ethidium bromide，EB),EB染色液工作液浓度：0.010.03mg/mlEB是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。,4、6 x Loading Dye,组成0.25%bromophenol blue（深蓝色）0.4%orange G（黄色）10mol/L Tirs-HCl(pH7.5),50mol/L EDTA使用量 5份DNA样品溶液加1份Blue/6xLoading Dye,操 作 步 骤,一、酶切反应,反应体系：DNA 5ul 10 x Buffer 2ul Hind III 3ul H2O 10ul Total 20ul混匀，37度保温30分钟,二、电泳,。,1、电泳前的准备工作 轻轻刷干净电泳制胶的梳子，模板，电泳槽，用蒸馏水洗净晾干，把制胶槽放入模板中。,2、制 胶(1)每组称取琼脂糖0.24g,倒入三角瓶，再往其中加入 30ml电泳缓冲液，微波炉加热直到琼脂糖溶化。（2)每组将琼脂糖液冷却到约70,轻轻倒入胶槽，并插 上梳子。凝固约30min.(3)取出梳子，把胶放在电泳槽中，准备电泳。,3、点样和电泳,(1)将酶切产物、自制DNA与6 x Loading Dye混 合，每个样品混合后体积均为24ul。a.自制DNA 20ul+4ul Loading Dye b.酶切产物 20ul+4ul Loading Dye(2)将标准DNA/Hand III、DNA、酶切产物、自制 DNA各10ul点入点样孔。(3)电泳。(4)EB染色10min。（注意不要污染实验室环境）,-DNA/Hind III Markers片段大小（bp）和电泳带型示意图,点样孔,23130,9416,6557,4361,2322,2027,4、紫外分析仪下看胶,23130,2322,2027,9416,6557,4361,警告,胶染色和观察时一定要带手套！,EB（溴化乙锭）诱变！,结果记录与分析,绘制电泳图谱,
