实验五DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电.ppt

实验五DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳,限制性内切酶,EcoR I Restriction Enzyme,识别序列：-GAATT C-C TTAAG-,Hind III Restriction Enzyme,识别序列：-AAGCT T-T TCGAA-,每一种限制性内切酶都有特定的反应条件 pH范围：7.58.0 缓冲液组份:Tris(三羟甲基氨基甲烷）NaCl、MgCl2、巯基乙醇 温度：37,琼脂糖凝胶电泳,是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸的方法。,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固,会形成良好的电泳介质。,电 泳,在电场的作用下，在某种支持介质上，将一个混合物分离成若干条区带的过程。,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,试 剂,TBE电泳缓冲液 45mmol/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH 8.0加样缓冲液 0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp)0.25%xylene cyanlo FF（天蓝色，2000bp）40%蔗糖EB（溴化乙锭）染色液（有毒）0.5ug/ml，用水配制,溴化乙锭(ethidium bromide，EB),是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。电泳结束后，将凝胶浸入 0.5ug/ml的EB溶液中染色10min。在紫外光照射下可见核酸电泳带，DNA量一般5ng。,操作步骤,酶切反应,反应体系 DNA 5ul 10 x Buffer 2ul Hind III 3ul H2O 10ul Total 20ul混匀，37度保温30分钟,制 胶,用电极缓冲液（0.5TBE）配制0.7%的琼脂糖胶20mL0.14g琼脂糖，20mL 0.5TBE微波炉加热至沸腾，确定琼脂糖完全溶解冷却至60左右准备好梳子和胶槽，倒入琼脂糖溶液，冷却凝固,点 样,Sample 1自提DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 2自提DNA酶切液20ul+4ul Loading Dye Sample 3-DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 4-DNA 酶切液20ul+4ul Loading Dye 点样：Sample 1和3各7ul Sample 2和4各10ul,电 泳,接通电源，150v电泳0.5小时,染色和观察,切断电源，取出胶模，将凝胶放入EB染色液中，染色10分钟取出凝胶，紫外灯下观察DNA电泳带型,警告,EB诱变染色和观察时一定要带手套！,提 示,1 自提DNA2 自提DNA/Hind III 3-DNA/Hind III 4-DNA,结果记录与分析,绘制电泳图谱,-DNA/Hind III Marker,-DNA/Hind III Marker 用Hind III彻底降解-DNA贮藏缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH7.5),10mol/L NaCl,1mol/L EDTA,-DNA/Hind III Markers片段大小（bp）和电泳带型示意图,点样孔,23130,9416,6557,4361,2322,2027,