实验三革兰氏染色实验.ppt

实验三 革兰氏染色法,河南城建学院环境科学与工程实验中心 环境生物技术实验室,一 目的要求：1、学习并初步掌握革兰氏染色法。2、了解革兰氏染色法的原理极其在细菌分类 鉴定中的重要性。,二 基本原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gran 创立的，基本步骤是：1、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：番红复染,经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。,Gram stain of Gram-,Gram stain of Gram+,实验原理：细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,Structure of a Gram-Negative Cell Wall Structure of a Gram-Positive Cell Wall,三、器材：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液，载玻片，显微镜等 四、操作步骤：1、涂片：将大肠杆菌（24h）和金黄色葡萄球菌（24h）分别涂片、干燥、固定。2、染色：（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗（3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约2030秒，立即用水冲净乙醇（4）复染：用番红液染1-2分钟，水洗,3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。4、混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。,步骤1：涂片,步骤2：干燥,步骤四 染色,步骤三 固定,crystal violet stain wash with water 结晶紫染色 水洗,Stain with grams iodine solution 碘液复染,Decolorize by adding 95%alcohol 95%酒精脱色,Counterstain with Safranin 沙黄复染,Results of stain染色结果,五 注意事项1）注意涂片不宜过。2）火焰固定温度要适宜。3）注意控制好脱色程度。,六、实验报告：1、结果：列表简述2株细菌的染色观察结果（形状、颜色、革兰氏染色反应）。2、思考题：1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键步骤是什么？2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？3）造成革兰氏染色结果不正确（假阴性或假阳性）的主要原因有哪些？,