实验七琼脂免疫扩散试验.ppt

龙岩学院生命科学学院,实验七、琼脂免疫扩散实验,一 实验目的：,理解双向琼脂免疫实验原理掌握双向琼脂免疫实验操作方法掌握双向琼脂免疫实验结果分析,二 实验原理：,当可溶性抗原(蛋白质、多糖、类脂、血清、各种微生物培养液等)与相应抗体在电解质存在的适当条件下相遇，经过一定时间出现肉眼可见的沉淀现象，称沉淀反应。用于此反应中的抗原又称沉淀原（precipitonogen）抗体则称沉淀素(precipitin)。可溶性抗原与抗体在含电解质的凝胶介质(通常用半固体琼脂，起支持作用)内自由扩散，当相对应的抗原抗体相遇时，若比例适当可出现白色沉淀线，称琼脂扩散试验（agar diffusion test）。沉淀线的形状、位置，与抗原的浓度、扩散速度相关。,此方法可应用于以下方面：（1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行初步估算。（2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗体）（3）抗原或抗体相对分子量的估计双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排孔型、梅花孔型（见图1）,图1 双向免疫琼脂扩散孔型,三孔型,双孔型,梅花孔型,双排孔型,三 实验材料：,1.高盐生理盐水的琼脂糖2.待检血清、法氏囊抗原、法氏囊阴、阳性抗体3.载玻片、湿盒、吸管、打孔器、37恒温箱、可调微量加样器等,四 操作步骤：,1.制板：用移液管吸取热琼脂3.5ml，平铺于载玻片上。2.打孔：待琼脂凝固后，按图1梅花孔型打孔，孔径3mm,中心孔与边缘孔距离3-5mm。用针头斜面向上轻轻挑去孔内琼脂（勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底）。3.封底：用酒精灯轻烤平皿底部致微烫，封闭孔底部，以防侧漏。4.加样：用微量加样器将法氏囊抗原10ul加入中间孔内；将待检血清用生理盐水稀释成1：2、1：6、1：10 以及空白（生理盐水）加入周围各孔中，每孔10ul。5.将玻璃片置于湿盒内，于37温育，隔天观察结果。,二、双向琼脂扩散试验,结果观察：沉淀线的位置、数目与形状等。,图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系,a、b：抗体 A、A、B：抗原A、B完全不同 A、A部分相同,五 注意事项,1.用琼脂浇载玻片时，载玻片必须保持水平位置，玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖时要避免产生气泡。2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被加满，又必须不使样品溢出孔外。3.打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。,六 思考题,1.画出个孔间的沉淀线位置、数量、形态，并予以简单的说明2.对实验结果进行分析,