实验一鸡卵类粘蛋白的分离与纯化.ppt
实验一 鸡卵类粘蛋白的 分离与纯化,【目的要求】,了解并熟悉鸡卵类黏蛋白的提取、分离、纯化的方法,掌握凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析、透析纯化等方法分离纯化鸡卵类黏蛋白的原理及操作方法。,【学科知识点】,选择性沉淀法从鸡蛋清中提取鸡卵类黏蛋白；凝胶层析法纯化鸡卵类黏蛋白粗提液；离子交换柱层析法进一步纯化鸡卵类黏蛋白提取液；透析纯化的方法去除样品中盐类；紫外分光光度法鉴定样品含量及纯度；有机溶剂等电沉淀法获得鸡卵类黏蛋白纯品。,实验内容,鸡卵类黏蛋白的提取,凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化,鸡卵类黏蛋白纯品的制备,鸡卵黏蛋白是一种糖蛋白，存在于鸡蛋清中，在10三氯乙酸或50丙酮溶液中有较好的溶解度。选择合适的pH值，三氯乙酸浓度和丙酮浓度，可以从蛋清中获得鸡卵黏蛋白的粗提液。,【基本原理】,鸡卵类黏蛋白的提取,【操作步骤】,1)取1个鸡蛋蛋清，量出体积，加入等体积的10 三氯乙酸溶液，形成类似于酸奶状的白色沉淀，搅拌均匀，在酸度计上检查pH值,若偏离3.5，则要用10 NaOH 溶液调至pH3.5 室温静置4h。,鸡卵类黏蛋白的提取,2)4h后,3000r/min离心10min。收集上清液，再用滤纸过滤，除去上清液中脂类物质及其它不溶物。滤液量体积，转入500 mL烧杯内，缓慢加入3倍体积冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，置冰箱放置2h。,鸡卵类黏蛋白的提取,3)小心虹吸出部分上清液，剩余部分全部转移到离心管里，经平衡后以3500r/min 离心10min，弃清液，沉淀物放在真空干燥器内，抽气除去残留丙酮。,4)离心管中加入20mL蒸馏水溶解，将溶解液用Sephadex G-25层析柱脱盐。,鸡卵类黏蛋白的提取,蛋白质混合溶液在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质沿颗粒间的空隙以较快的速度流过凝胶柱，最先流出柱外。而盐或其他小分子物质因进入凝胶颗粒的微孔中向下移动的速度较慢，所以最后流出柱外。因此通过凝胶层析可以达到除去小分子物质的目的。,凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化,【基本原理】,凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化,凝胶层析分离原理示意图,1）凝胶的处理 量取100mL Sephadex G-25凝胶，加入200mL磷酸盐缓冲液，沸水浴中1h。上柱前用真空干燥器抽气。,【操作步骤】,凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化,2）装柱 将柱子垂直地安装好，关闭层析柱出水口，将脱气后的凝胶缓缓地倒进柱内，使之自然沉降。,3）平衡 打开核酸蛋白检测仪、记录仪电源，将柱出水口与核酸蛋白检测仪比色池进液口相连，开启柱口下夹子，用约2倍体积的pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。直至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线。,凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化,4)上样 取样品溶解液上Sephadex G-25层析柱。控制流速15d/min，收集蛋白峰。即可得到鸡卵类黏蛋白粗提液。并准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。,凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化,【基本原理】,初步提取得到的鸡卵类粘蛋白，经DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白。得到鸡卵类粘蛋白的纯溶液。然后经透析、丙酮沉淀、抽真空干燥即可获得鸡卵类粘蛋白纯品。,鸡卵类黏蛋白纯品的制备,1)量取已处理的DEAE-纤维素50 mL，用60 mL pH 6.5 磷酸盐缓冲液浸泡约15mim，脱气。,2）装柱 将脱气后的DEAE-纤维素装入柱内。用pH 6.5 磷酸盐缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线即可加样。,【操作步骤】,鸡卵类黏蛋白纯品的制备,4)洗脱 改用含0.3mol/LNaCl的pH6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰。,3)上样吸附 取经上述纯化后的鸡卵类粘蛋白粗品上样，待样品全部流入柱床后，用pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，洗去未被吸附的杂蛋白。,鸡卵类黏蛋白纯品的制备,5)透析除盐 将层析收集的蛋白溶液放入透析袋内，对蒸馏水进行透析，间隔1h更换一次蒸馏水，直至经1%AgNO3检查无氯离子为止（过夜）。,6)量透析后蛋白样品体积。取出1mL,稀释10倍，在紫外分光光度计280nm处测定鸡卵类粘蛋白的含量。剩余样品用1mol/L HCl调至pH4.0。,鸡卵类黏蛋白纯品的制备,紫外分光光度计,7)蛋白溶液中加入3倍体积冷丙酮，用塑料薄膜封口，放入冰箱静置4h。,8)倾去上清，浑浊液转到离心管内，于 3500r/min 离心10min,沉淀抽真空干燥，即可得到透明胶状物鸡卵类粘蛋白。,鸡卵类黏蛋白纯品的制备,BA,1)鸡卵类粘蛋白（mg/mL）=2)鸡卵类粘蛋白的产率（mg/mL）=100mL鸡蛋清得到鸡卵粘蛋白的mg数。3)绘制Sephadex G-25柱层析分离鸡卵粘蛋白的层析图。4)绘制离子交换柱层析分离鸡卵粘蛋白的层析图。,A280稀释倍数,0.413,实验结果与数据处理,【思考题】在鸡卵粘蛋白的提取、分离及纯化过程中，直接影响产率的是哪几步？操作过程中应当注意什么？,实验结束,
