部分免疫项目检测路径及结果分析讲.ppt
抗TP、抗HIV、抗HCV的检测路径及结果分析,德阳市人民医院检验科 刘利洪,梅毒螺旋体抗体(抗TP-Ab)检测路径及结果分析,一、梅毒血清学检测程序,梅毒螺旋体抗原血清试验（TP-ELISA、TPPA等）,梅毒血清学检测程序的比较,（1）先以非梅毒螺旋体抗原血清试验（RPR、TRUST等）进行初筛，再以梅毒螺旋体抗原血清试验（TPPA、TPHA、TP-ELISA等）进行确认。优点：非梅毒螺旋体抗原血清试验价格低廉，使梅 毒检测的成本可以保持在低水平 缺点：非梅毒螺旋体抗原血清试验的敏感性较差，导致临床上易出现漏检的情况(2)同时进行梅毒螺旋体抗原血清试验和非梅毒螺旋体抗原血清试验 优点：这是从技术上而言的最佳方案 缺点：人力和试剂成本较高(3)先进行梅毒螺旋体抗原血清试验，阳性时再进行非梅毒螺旋体抗原血清试验 优点：可分清现症病人或既往感染，人力和试剂成本较低。,二、梅毒的血清学试验（1）,梅毒血清学实验方法分为两大类：非梅毒螺旋体抗原血清试验和梅毒螺旋体特异性抗原血清试验。非梅毒螺旋体抗原血清试验：是以心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原检查血清中的反应素，用于初筛试验及疗效观察。可以分为以下四种试验，原理基本相同：1、性病研究实验室玻片试验（VDRL)：由于试剂需现配现用，故而国内实验室很少采用。但VDRL是唯一可用于神经性梅毒诊断的血清学方法。2、快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)：在特制的纸片上进行，加入一定量特制的炭粉，可使抗原抗体出现凝集，用肉眼可观察结果。3、甲苯胺红试验（TRUST)：在试剂中加入甲苯胺红代替炭粉颗粒，使结果更易于观察。4、不加热血清反应素试验（USR),梅毒的血清学试验（2）,非梅毒螺旋体抗原血清试验的缺陷：1、特异性：由于在多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、结缔组织病、静脉吸毒者以及怀孕妇女中均可出现反应素，所以此类试验有时会出现假阳性反应。2、敏感性：非梅毒螺旋体抗原血清试验有时出现弱阳性或阴性结果，而临床上又像二期梅毒，此时应将此血清稀释后做定量试验，如出现阳性结果，则为抗体过量引起的前带现象。12二期梅毒病人可出现此现象而发生梅毒血清假阴性反应。此外，由于感染梅毒后反应素的出现晚于特异性梅毒螺旋体抗体，晚期梅毒反应素又可能转阴，因此这类试验不适于一、三期梅毒，对隐性梅毒和神经梅毒也不敏感。因此此类试验做梅毒初筛时，存在一定数量的漏检。非梅毒螺旋体抗原血清试验的优点：1、非梅毒螺旋体抗原血清试验表现为滴度随疗程逐渐下降，故可以作为疗效观察的指标。2、此类方法价格低廉。,梅毒的血清学试验(3),梅毒螺旋体抗原血清试验：用梅毒螺旋体作为抗原检测血清中的抗梅毒螺旋体IgM和/或IgG抗体，其敏感性和特异性均较高。常用的有以下五种方法：1、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS)2、梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）3、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA)4、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）5、梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT）,梅毒的血清学试验(4),荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS)FTA-ABS是所有螺旋体试验中最敏感的方法，特异性也很高，被认为是检测梅毒的“金标准”。但是，该方法在技术操作上也是最困难的，试验的操作以及结果的判读都必须加以核实。试验可靠性的关键是标准化的结果判断、高质量的荧光标记抗体以及适当的稀释度。由于实验室操作繁琐以及主观判读经常产生错误结果，因此增加标记荧光标记染料的复染可以减低标准化过程中的错误并增加其可读性及重复性。实验需有优质的荧光显微镜和技术熟练的操作人员才能得到准确的结果，故常不被临床实验室作为首选方法。,梅毒的血清学试验(5),梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）原理：用超声裂解的梅毒螺旋体为抗原，致敏经醛化 鞣化的羊或禽类红细胞，此致敏红细胞与人血清 或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可观察的凝集反应优点：该方法比FTA-ABS易操作且稳定性好，它的敏感 性除早期梅毒外与FTA-ABS相似，对大样本进行 批量检测时，TPHA也比FTA-ABS易操作，是国内实验室常用的梅毒螺旋体确证试验方法。不足：由于红细胞具有生物活性，可能产生非特异性凝 集，且保存时间较短，批间差较大,故实际使用中 也存在一些问题。目前国内使用的商品化 TPHA试剂盒均未通过国家的批批检,梅毒的血清学试验(6),梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）原理：TPPA的原理与TPHA基本相同，它以人工合成的惰性明胶颗粒代替TPHA试验的红细胞作为载体。是TPHA的升级产品。优点：1、试剂稳定，批间差小2、结果判读更为清晰明确3、敏感性和特异性较TPHA进一步提高4、通过了国家的批批检,梅毒的血清学试验(7),梅毒螺旋体酶联免疫试验（TP-ELISA）原理：以梅毒螺旋体抗原包被聚丙乙烯板，再加入待检血清以及酶标抗原，形成双抗原夹心，同时检测IgG、IgM抗体。少数试剂采用间接法，检测IgG优点：1、敏感性和特异性较高2、价格较低，适合于对大量样品的筛查3、可实现操作的自动化、客观化不足：各家ELISA试剂盒采用的抗原和工艺不同，使测定的敏感性和特异性产生较大的差异，临床实验室在选用ELISA试剂前应认真进行评估,梅毒的血清学试验(8),梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT）原理：双抗原夹心免疫层析试验或间接法免疫渗滤试验，多采用胶体金进行标记，同时检测IgG、IgM抗体（双抗原夹心法）或单测IgG抗体（间接法）优点：1、简便、快速，不需要特殊的仪器2、适合于单人份操作，可用于较紧急的场合 不足：1、临床评估资料不多，敏感性、特异性尚有待进 一步考查2、无法实现自动化，结果判断主观3、测定结果受温度和时间的影响较大4、未通过国家的批批检5、价格较高,梅毒血清学检测的几个特点,(1)在最初的两周可能是阴性结果(2)FTA-ABs、TPPA和TP-ELISA在所有阶段都最敏感(3)VDRL和RPR在三期梅毒期可能为阴性(4)VDRL-CSF仅用于诊断神经性梅毒,梅毒检测各种方法的比较,血清学实验结果的解释:,梅毒血清假阳性反应（1）技术性假阳性反应：如实验室操作错误，标本溶血等，如重复试验，无梅毒患者血清试验成为阴性。（2）生物学假阳性反应：因非螺旋体抗原血清试验是非特异性的，在其它一些疾病，尤以感染性疾病，也可释放心拟脂至血液中，产生反应素，如麻风、麻疹、疟疾、传染性肝炎、病毒性肺炎、传染性单核细胞增多症，系统性红斑狼疮，非典型性肺炎、甚至妊娠都可出现阳性，但这类患者血清反应滴度低，很少超过1：8,而且半年内渐转成阴性。另外可用特异性的梅毒血清反应证实。如用FTAABS试验。,血清学实验结果的解释,假阴性反应：（1）在梅毒螺旋体感染后12周内可呈阴性反应。（2）梅毒螺旋体感染不久即开始治疗。（3）晚期梅毒患者的血清中反应素含量低。（4）敏感性低的梅毒血清试验易出现阴性反应（5）在二期梅毒时RPR试验也可出现阴性反应，前带现象(prozone phenomenon),三个特殊人群的梅毒诊断,一、先天性梅毒的诊断先天性梅毒的诊断要结合流行病学史：生母为梅毒患者；临床表现；实验室检查：暗视野显微镜检查、血清学检查（非梅毒螺旋体抗原实验和梅毒螺旋体抗原血清学实验阳性）进行综合判断。由于母体的螺旋体直接进入胎儿的血循环，因此先天性梅毒均直接表现为二期梅毒。如果母血及新生儿血TRUST实验阳性，可能是先天性梅毒，也可能不是。必须在2月后复查其效价，婴儿血清效价持续不变，甚至增高，则考虑婴儿已被梅毒感染。反之，效价降低及转阴，继续观察血清反应及临床症状，6个月仍为阴性，则可排除被感染。婴儿血清反应持续阳性及滴度增高时，需要立即接受抗梅毒治疗，防止病情发展。,二、老年人:老年人群（特别是80岁以上）的梅毒抗体阳性率要高于其他人群，但许多梅毒螺旋体抗原血清试验和/或非梅毒螺旋体抗原血清试验呈阳性的老年病例并没有明显的临床症状。这可能是既往感染或隐性感染的情况，也可能是检测方法的假阳性所致，但一般情况下很难明确区分。实验室应明确记录检测结果，并建议临床根据实际情况进行处理。,三、孕妇 晚期妊娠时，少数情况下可突然出现梅毒特异性抗体和/或反应素阳性，应提醒临床注意既往梅毒感染复发或假阳性的可能性，并进行随访观察。,梅毒血清试验结果判断,TRUST TPHA FTA-ABS TPPA 反应结果判断 阴性 阴性 阴性 阴性 排除梅毒感染初期，尚未产生任何 抗体；AIDS病人合并感染梅毒 阴性 阴性 阳性 阳性 既往患梅毒，对FTA-ABS及TPPA非 特异性反应 阳性 阴性 阴性 阴性 生物性假阳性(BFP)，可疑早期梅毒 阳性 阴性 阳性 阳性 早期梅毒，陈旧性梅毒 阴性 阳性 阴性 阴性 梅毒治愈，对TPHA非特异性反应 阴性 阳性 阳性 阳性 先天梅毒，梅毒治愈，其它螺旋体感染 阳性 阳性 阴性 阳性 可疑既往患梅毒，梅毒螺旋体抗体消失 阳性 阳性 阳性 阳性 梅毒(治愈或未治愈),抗HIV检验路径及结果解释,一、抗HIV筛查检测路径,HIV初筛实验（抗HIV-ELISA、金标法、硒标法等）,二、抗HIV检验方法：,ELISA法：HIV初筛实验方法金标法：快速过筛硒标法：快速过筛蛋白印迹法：确认实验方法PCR法：病毒载量测定，用于评估病情，估计感染量，不是确认方法。,抗HIV实验方法分类:,（一）初筛实验：主要采用ELISA法，对呈阴性反应的样品，可出具“艾滋病病毒(HIV)抗体筛查报告”，报告为阴性；对呈阳性反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。（二）复检试验：对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告“艾滋病病毒(HIV)抗体筛查报告”阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，则按检测管理规范的要求送艾滋病确认实验室进行确证试验。（三）确认实验：目前常用的是免疫印迹法，由HIV确认实验室检测，一般医院都未进行此类检测。,三、检验结果的解释,1.艾滋病病毒(HIV)抗体检测的初筛结果有二种：阴性、待确证，阴性结果直接报告，待确证的结果要收集患者的信息资料，送HIV确认实验室确认。同时做好患者的咨询服务工作。2.确认结果有三种：阳性、阴性和不确定，绝大多数情况下都是阳性或阴性，出现不确定结果的情况很少。,（一）、阳性结果的解释（1）,1、表明一个人感染了艾滋病病毒(HIV)，具有传播性。当一个人艾滋病病毒(HIV)抗体检测结果为阳性，表明这个人已经感染了艾滋病病毒(HIV)，具有把艾滋病病毒(HIV)传播给别人的可能。,2、不能判断发病与否，不能判断疾病的进展。艾滋病病毒(HIV)抗体检测结果只能说明一个人是否感染了艾滋病病毒(HIV)，阳性结果并非就意味着一 个人已经得了艾滋病，也不能说明患者处于疾病发展的哪个阶段。若要判断疾病的进展，则要做另外的实验检测CD4/CD8细胞记数和艾滋病病毒(HIV)病毒载量检查。,（一）、阳性结果的解释（2）,（一）、阳性结果的解释（3）,3、对于刚出生的婴儿，情况则不一样。刚出生的婴儿，不能根据其艾滋病病毒(HIV)抗体检测呈阳性反应而判断该婴儿感染了艾滋病病毒(HIV)。因为出生半年以内的婴儿，其抗体主要是由该婴儿从其母体获得，不管他(她)感染艾滋病病毒(HIV)与否，只要其母亲感染了艾滋病病毒(HIV)，母体内存在艾滋病病毒(HIV)抗体，婴儿出生后艾滋病病毒(HIV)抗体检测一般都是阳性。如果要判断一个婴儿是否感染艾滋病病毒(HIV)，则应该等到一岁半(1 8个月)以后再做检测，检测结果阳性时才能说明该婴儿感染了艾滋病病毒(HIV)。,（二）、阴性结果的解释（1）,1、检测者处于窗口期 艾滋病病毒(HIV)从感染到能够检测出来有一段时期，这段时期称为窗口期，窗口期一般是2周到2个月。拿到一个阴性结果，首先要确定窗口期是否已过，如果确定最后一次危险的行为距抽血作检测时已过窗口期，这时基本可以确定检测者未感染艾滋病病毒(HIV)。如果窗口期未过或者抽血化验之后又发生了危险行为(如又共用针具或未采取保护措施的性行为)，同样也不能确定抽血者没有感染艾滋病病毒(HIV)。,（二）、阴性结果的解释（2）,2、检测者未感染艾滋病病毒(HIV)如果检测结果阴性，最后一次危险行为又过了窗口期，那可以判定检测未感染艾滋病病毒(HIV)。,（三）、不确定结果的解释（1）,结果不确定是指在进行艾滋病病毒(HIV)抗体检测的确认试验时，检测结果不是阴性，又够阳性标准，界乎于阳性与阴性之间的一种结果。出现不确定结果一般建议过三个月后再复查，出现不确定结果一般有以下几种原因：1、感染处于窗口期，从艾滋病病毒(HIV)进人体内到检测这段时间还不够长，因此血清还没有形成典型的抗体反应。,（三）、不确定结果的解释（2）,2、艾滋病进展到终末期，抗体水平下降。3、有其它原因：如某些恶性疾病，怀孕，输血或器官移植等情况，身体会产生一些抗体，其反应与艾滋病病毒(HIV)的某些蛋白抗体所引起的反应相似。,抗HCV检测路径及结果解释,一、抗HCV检测路径,二、抗HCV检测的相关实验,1、血清学检测：（1）筛选实验：主要采用ELISA法，用重组或合成丙肝病毒多肽（如C22,NS3NS5等非结构蛋白）作为包被抗原。已发展到第三代，本法快速，作为常规方法。（2）确认实验：RIBA（重组蛋白印迹法）主要用于ELISA法初筛检测可疑者，但本法试剂成本太高。2、核酸检测：HCV-RNA，检测丙肝病毒的RNA,本法灵敏度高。检测时间长，检测成本较高。3、核心抗原检测 是新近发展起来的检测HCV感染的新方法，可用于检测HCV感染和监测HCV的复制水平，该法灵敏、准确、特异。,三、检测结果的分析,目前尚无证据说明抗HCV是保护性抗体，抗HCV存在仅表明HCV 的感染。HCV RNA为丙型肝炎早期诊断最有效指标。在急性丙型肝炎过程中，HCV RNA可以由阳性转阴性，抗HCV筛查、确认实验和HCV RNA检测结果的分析如下：,抗HCV筛查及确认试验结果的分析,抗HCV筛查及确认试验结果的分析,谢 谢,
