高效毛细管电泳法.ppt

1,第十三章 高效毛细管电泳法,电泳是溶液中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象。利用这种现象对化学和生物化学组分进行分离分析的方法称之为电泳法。电泳法已有近百年历史，传统的电泳技术由于受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低。上世纪80年代初,细径毛细管被用于电泳，由此产生了一种新型的分析技术毛细管电泳（CE）,也称为高效毛细管电泳（HPCE）。,CE开始主要用于蛋白质，多肽的分析,以后逐渐被广泛应用于生物，化学，医药，环保等领域。它具有分离效率高，分析速度快，样品及试剂用量少,洁净无污染等特点,和高效液相色谱法成为分析化学中互补的技术。随着生命科学的发展，毛细管电泳技术也有了广阔的发展空间。目前，不同分离模式的毛细管电泳技术正成为最重要的医学生物样品分离分析手段。,2,第一节 毛细管电泳的特点和分类,一、电泳和色谱,毛细管电泳和色谱都是一种分离分析方法，两者比较如下：,1.分离原理,电泳是溶液中带电粒子在电场力作用下发生定向运动，因粒子所带电荷数、形状、大小等不同，导致不同的迁移速度而分离。色谱是不同组分在流动相的推动下，由于在固定相流动相中的分配系数不同，导致不同的迁移速度而分离。但某些毛细管电泳的分离模式也包含了色谱的分离机制。,2.分离过程,电泳和色谱的分离过程都是差速迁移过程，可用相同的理论来描述。色谱中所用的一些名词概念和基本理论，如保留值、塔板理论、速率理论等均可借用于毛细管电泳中。,3.仪器流程,3,二、毛细管电泳的特点,1.柱效高,高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,色谱仪和电泳仪（HPLC和CE），都包括进样部分、分离柱、检测器和数据处理等。,4,2.消耗低,CE所需样品为nl级,流动相用量也只需几毫升,而HPLC所需样品为l级,流动相则需几百毫升乃至更多。,3.速度快,一般几十秒至十几分，最多半小时，即可完成一个试样的分析。,4.应用广泛,可用于有机物、无机物、生物大分子等的分离和分析，在药学、化学、环境保护、材料科学特别是在分子生物学、医学等领域有着广泛的应用。,三、毛细管电泳的分类,按分离模式分类，常用的技术有六种：,毛细管区带电泳，胶束电动毛细管色谱，毛细管凝胶电泳，毛细管等电聚焦，毛细管等速电泳，毛细管电色谱,5,毛细管区带电泳是CE中最基本、应用最普遍的一种模式。,第二节 基本原理,一、电泳和电泳淌度,在一定电场强度作用下，溶质带电粒子在溶液中的定向移动（迁移），这种现象称为电泳。带电粒子在电场中迁移时，所受的电场力为,q:溶质离子所带的有效电荷 E:电场强度,带电粒子在溶液中运动时受到的阻力即摩擦力为,是电泳速度,1.电泳与电泳速度,6,f为摩擦系数，其大小与带电粒子的大小、形状以及介质粘度有关。对于球形离子，f=6；对于棒状离子，f=4。式中，是溶质离子的动力学半径，是电泳介质的粘度。,平衡时，电场力和摩擦力相等，即,qE=fvep,电泳速度为,不同物质在同一电场中，由于它们的有效电荷、形状大小的差异，它们的电泳速度不同，所以可能实现分离,7,我们把溶质在给定溶液中和单位电场强度下的电泳速度称为电泳淌度，用ep表示。,所以淌度不同是电泳分离的内因和前提。,溶质粒子的电泳速度决定于粒子淌度和电场强度的乘积，,vep epE,2电泳淌度,在一定条件下，不同粒子的形状、大小以及所带电量都可能有差别，则电泳淌度也可能不同。,8,3有效淌度,在实际溶液中，离子活度系数、溶质分子的离解程度和溶液的酸度等均对离子的淌度有影响，这时的淌度称为有效淌度，用ef 表示。,二、电渗和电渗流,1电渗现象,当固体与液体相接触时，如果固体表面因某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带相反电荷，当液体两端施加一定电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，我们把这种液体相对于带电固体表面移动的现象叫做电渗。,9,目前，高效毛细管电泳大多使用石英毛细管，在内充缓冲液PH2时，管壁的硅醇基（SiOH）开始部分离解成硅醇基阴离子（SiO），使管壁带负电荷，并由此吸引溶液中的阳离子，在管壁和溶液之间形成双电层。毛细管内壁的双电层及其电势分布见下图。,10,在外电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层中的阳离子向阴极移动。由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，这就是毛细管电泳中的电渗现象。,2。电渗流（electroosmotic flow，EOF）,电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流。,11,3.电渗流的大小和方向,电渗流的大小用电渗流速度vos表示，其大小决定于电渗淌度os和电场强度E。即,式中，、分别是电泳介质的介电常数和粘度,毛细管壁的Zeta电位，它近似等于扩散层与吸附层界面上的电位。一般来说，扩散层内净电荷数（正电荷数）越多、扩散层厚度越薄，Zeta电位越大。,12,实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 Lef毛细管有效长度；tos电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。,在一般情况下，电渗流的速度是电泳速度的57倍。,电渗流的方向取决于毛细管内壁表面电荷的性质。一般情况下，石英毛细管内壁表面带负电荷，则电渗流带正电荷，向负极移动。但如果将毛细管内壁改性，比如在在内壁表面涂渍或键合一层阳离子表面活性剂，将使壁表面带正电荷，则电渗流带负电荷，向正极移动。,4.电渗流的流形,13,由于扩散层中的过剩阳离子均匀分布，所以在外电场驱动下产生的电渗流为平流，即塞式流形。液体流动速度除在管壁附近因摩擦力迅速减小到零以外，其余部分几乎处处相等。这一点和HPLC中靠泵驱动的流动相的流形完全不同。,14,HPLC流动相的流形为抛物线形的层流，在管壁处的速度为零，管中心的速度是平均速度的2倍。,平流引起的谱峰展宽很小，而层流引起的谱峰展宽较大。,电渗流呈平流是毛细管电泳能获得较HPLC更高分离效率的重要原因。,4.电渗流的作用,在一般情况下，电渗流流向负极，电渗流速度约等于一般离子电泳速度的57倍。所以，各种电性物质在毛细管中的迁移速度为两种速度的矢量和，称为表观电泳速度，用vap表示。,15,阳离子：vapvos+vep阴离子：vapvosvep中性分子：vapvos,当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管。出峰次序是：阳离子中性分子阴离子中性分子与电渗流速度相同，不能互相分离。,vap=apE=(osep)E,ap称为表观淌度。,ap=osep,16,电渗流具有像HPLC中泵一样的作用，推动离子前进，加上不同离子电泳速度和方向的差异，完成阳离子、阴离子和中性离子的分离。,改变电渗流的大小和方向，可以改变分离效率和选择性。这是HPCE中优化分离的重要因素。,电渗流在HPCE 的分离中起着极其重要的作用：,电渗流的微小变化影响分离结果的重现性。电泳中影响电渗流的因素很多，应设法控制电渗流的恒定。,17,三、HPCE中影响电渗流的因素,1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,18,3.电解质溶液性质的影响,（1）溶液pH的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。,19,20,4.温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%3%；,21,5.添加剂的影响,（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。,（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向 某些阳离子表面活性剂使电渗流减小，某些阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，电渗流增大（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。,22,23,四、柱效和分离度,（一）理论塔板数和塔板高度,引入与色谱相似的处理和表达方法，用理论塔板数n和塔板高度H表示柱效。n可以直接由电泳图求出,tm为起点到谱峰最高点所对应的时间，称为迁移时间。因为毛细管中，没有固定相，不存在组分在固定相中分配和保留。,塔板高度H为：,Lef为进样口到检测器的距离,为有效柱长.检测器在柱上，LefL,24,（二）谱带展宽,在理想的情况下，纵向扩散是HPCE中导致谱带展宽的唯一因素。根据范第母特方程,1.纵向扩散,D是溶质组分的扩散系数,V是电压，L是毛细管全长。,纵向扩散与扩散系数成正比，与表观电泳速度成反比。,若只考虑纵向扩散，则理论塔板数为,由上式可知，n与电场强度E（或电压V）成正比，与溶质的扩散系数成反比。,25,在HPCE中，溶质在几万至十几万伏的电压下，迁移速度较快，纵向扩散小，柱效高。因为分子越大扩散系数越小，所以毛细管电泳特别适合分析生物大分子。,2.自热,自热是指当毛细管两端施加电压，电流通过缓冲液时产生的热量，也称焦耳热。焦耳热通过管壁向周围环境散热，管中心温度最高，由中心向管壁温度逐渐下降。溶液的粘度与温度有关，温度高粘度小，因而管中心的迁移速度最快，管壁附近的迁移速度最慢，破坏了溶质带的扁平流轮廓，导致溶质区带展宽。,在实际电泳过程中，出了溶质的纵向扩散外，还存在很多引起谱峰展宽的因素，如自热、吸附等。,小内径毛细管散热面积大，温度梯度小，谱峰展宽小。,3.吸附,26,毛细管内壁对靠近内壁的溶质粒子的吸附，使迁移速度减慢，导致谱峰变宽。造成管内壁表面吸附的主要原因有两个:,在电解质溶液PH大于3时，石英毛细管壁带负电荷，因静电引力溶质阳离子被管壁吸附。,蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，有较强的疏水作用，被极性水溶剂向管壁挤压，在PH小于3，管壁呈电中性时尤为明显。,细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。,（三）分离度,毛细管中的分离度也用R表示，可按谱图直接由下式计算：,27,分离度也可表示为柱效的函数：,影响分离度的主要因素：工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；表观淌度差。,第三节 毛细管电泳仪,毛细管电泳仪结构比高效液相色谱仪 简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器等。前三个部件均易实现,困难之处在于检测器。,28,29,30,一、高压电源,（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；,二、电极槽,CE的电极通常由直径0.5 1 mm的铂丝制成，电极槽通常是带螺口的小玻璃瓶或塑料瓶（1 5 mL不等），要便于密封。,31,三、进样系统,一般的进样方式是电动进样和压力进样。电动进样是将毛细管柱的一端及其相应端的电极从缓冲池中移出，放入试样杯中，然后在一准确时间范围内施加电压，使试样因离子移动和电渗流进入毛细管柱。压力进样是用压差使试样溶液进入毛细管。产生压差的办法可以采用在出口端抽真空，或者通过进样端加压。,进样体积一般在纳升级，进样长度必须控制在毛细管总长度的1%2%，否则将影响分离效率。,32,四、毛细管柱,常用弹性石英毛细管，内径50m和75m两种使用较多（毛细管电色谱有时用内径再大些的毛细管）。细内径分离效果好，且焦耳热小，允许施加较高电压，但若采用柱上检测因光程较短，检测限比较粗内径管要差。毛细管长度称为总长度，根据分离度的要求，可选用20100cm长度，进样端至检测器间的长度称为有效长度。,毛细管柱中充入缓冲溶液，柱的两端置于两个缓冲池中。毛细管常盘放在管架上控制在一定温度下操作。,33,34,五、检测系统,紫外-可见光分光检测、激光诱导荧光检测、电化学检测和质谱检测均可用作毛细管电泳的检测器，其中以紫外-可见光分光光度检测器应用最广。,将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去约2mm一段，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达光电池。,六、数据处理系统,与一般色谱数据处理系统基本相同。,35,36,第四节 分离模式及其分离条件的选择,一、毛细管区带电泳（CZE）,毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电泳,是毛细管电泳中最简单，应用最广泛的一种形式。这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满。带电粒子的迁移速度是电泳和电渗流速度的矢量和。不同离子按照淌度的差异,以不同的速度在电解质中移动,而实现分离。,（一）分离原理,37,在一般情况下，电渗流流向负极，电渗流速度约等于一般离子电泳速度的57倍。当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管。首先是最快的阳离子，紧接着是依次减慢的阳离子，然后是全部的中性分子在一个区域出现，最后是最慢的阴离子，紧接着的是依次加快的阴离子。,38,39,（二）分离条件的选择,1缓冲液,电泳过程在缓冲液中进行，缓冲液的选择直接影响粒子的迁移和最后的分离.,缓冲液的选择通常须遵循下述要求：,（l）在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量；,（2）在检测波长处无吸收或吸收值低；,（3）自身的淌度低，即分子大而荷电小，以减少电流的产生,（4）为了达到有效的进样和合适的电泳淌度，缓冲液的pH值至少必须比被分析物质的等电点相差l个pH单位。,40,(5)只要条件允许就尽可能采用酸性缓冲液，在低pH值下，吸附和电渗流都很小，毛细管涂层的寿命较长。,在配制毛细管电泳用的缓冲液时，必须使用高纯蒸馏水和试剂，另外用前要用0.45m的滤器过滤以除去颗粒等。,41,一些常用缓冲溶液及其pKa值,42,2添加剂,在CZE分离中，常常还在缓冲溶液中添加某种试剂，通过它与管壁或与样品溶质之间的相互作用，改变管壁或溶液相物理化学特性，进一步优化分离条件，提高分离选择性和分离度。,常用添加剂有表面活性剂、有机溶剂、中性盐类、两性物质和手性选择剂等，,3工作电压,电压是控制柱效n、分离度Rs和迁移时间tm的重要因素。在焦耳热可以忽略的条件下，外加电压增大，分离时间缩短、柱效和分离度提高,43,但电压升高，产生的焦耳热增多，在不能有效地驱散所产生的焦耳热情况下，柱温显著升高，工作电流增大，柱效和分离度降低。,以在CE分离条件优化时，除了采取有效的散热措施外，选择一种合适的条件，使在此条件下允许使用较高电压，而不致产生过高的电流和过多的焦耳热，是非常重要的。,二、胶束电动毛细管色谱（MECC）,胶束电动毛细管色谱是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂，胶束相在分离中起到了准固定相的作用，是电泳技术与色谱技术的结合。,44,把离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)加到缓冲液中,当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电,但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度,故胶束将以较低速度向负极移动。,（一）分离原理,45,带电粒子不仅可以由于淌度差异而分离，同时又可基于在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配差异而分离。,中性粒子按其疏水性不同，在缓冲溶液和胶束之间分配。疏水性强、亲水性弱的粒子分配到胶束中的多，分配到缓冲溶液中的少；反之，亲水性强、疏水性弱的溶质分配到胶束中的少，分配到缓冲溶液中的多。当溶质进入胶束时，以胶束的速度迁移；溶质进入缓冲溶液时，以电渗的速度前移。在胶束中分配系数越大的粒子，在柱中迁移速度慢。从而使疏水性稍有差别的中性物质在电泳中得以分离。,46,MECC的突出优点是除能分离离子化合物外，还能分离不带电荷的中性化合物。对含有离子和中性化合物的混合样品，以及电泳淌度相同的溶质的分离，MECC要明显地优于CZE。,47,（二）分离条件的选择,胶束准固定相对MECC分离过程起着重要作用。,典型的准固定相为各类表面活性剂，对其要求是：,经济易得；水溶性好形成的胶束必须均匀、透明，不吸收UV光 对样品无破坏性；胶束具有足够的稳定性临界胶束浓度CMC不宜太高,48,一些常用的表面活性剂及其临界浓度,49,三、毛细管凝胶电泳（CGE）,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成一个细长的网状多孔凝胶，其具有多孔性，类似分子筛的作用。电荷/质量比相等但大小不同的分子，在电场力的作用下发生迁移，其运动速度受到凝胶网状结构的阻碍。大分子受到的阻力大，移动速度慢，小分子受到的阻力小，移动速度快，从而使它们得以分离。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，在CZE模式中，淌度几乎没有差别，很难分离，采用CGE能获得良好分离，是研究DAN排序的重要手段。,50,四、毛细管电色谱（CEC）,将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁键合固定相，毛细管两端施加高电压，以电渗流驱动操作缓冲液。它也包含了电泳和色谱两种机制，溶质根据它们在流动相和固定相中的分配系数不同和自身淌度的差异得以分离。,电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体动力学轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相色谱法高。目前反相毛细管电色谱研究应用最多。,