高效毛细管电泳仪.ppt
高效毛细管电泳仪（high performance capillary electrophoresis,HPCE）,主要内容,电泳的基本原理电泳的影响因素毛细管电泳的基本结构毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的临床应用,一、电泳的定义,电泳（electrophoresis，EP）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresis technique）,二、电泳发展简史,1、1937年 瑞典科学家 A.Tiselius首先提出的，后来A.Tiselius又和他的同事们一起第一次从人的血清中分离出白蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白，由于A.Tiselius对电泳技木发展和应用的杰出贡献，使他成为1948年诺贝尔化学奖的得主,2、1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。3、1959年Raymond 和Weintraub 利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。4、1967年 Hjerten最先提出在高电场强度，直径为3mm的毛细管中作自由溶液的区带电泳(CZE,capillary zone electrophoresis)。,三、电泳原理,物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。,电泳原理,若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：F引=E Q（6-1）在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6rV（6-2）当F引=F阻时 EQ=6rV V=EQ/6r（6-3）由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度()成反比。,电泳原理,电泳迁移率（Electrophoreticmobility,），表示单位电场下带电粒子的运动速度。e=v/Ee=q/6r对于一定的荷电粒子或离子，电泳迁移率是该粒子的特征常数。颗粒带净电荷量越大或其直径越小，其形状越接近球形，在电场中泳动的越快；反之，则越慢。设d为粒子电泳移动距离，t为电泳时间，则电场强度E为单位距离内的电位差（），设L为两极间的距离，即,合并上面两式：设有A和B两种带电粒子，它们能否在电场中电泳分离，可由它们的移动距离的差值来判断，设A和B的电泳移动距离分别为 和，两物质移动的距离差为：由此可知，物质A和B能否分离，决定于两者的迁移率。,四、影响电泳的因素,电场强度：电场强度越大，带电粒子泳动越快溶液的pH值：pH值离等电点愈远，粒子所带静电荷越多，电泳速度愈快。等电点（isoelectric point,pI):当溶液的酸碱度处于某一特定pH值时，它将带有相同数量的正负电荷，致使蛋白质分子在电场中不会移动，此特定的pH值被称为。溶液离子强度：强度愈高，电泳速度愈慢。适宜强度0.020.20mol/kg.,四、影响电泳的因素,电渗：液体相对于固体支持物的移动。泳动方向与电渗方向一致时，则加快泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。温度：温度每升高10c,迁移率增加2.4%迁移率：,五、常用的电泳方法,纸电泳：用滤纸作为支持载体的电泳方法醋酸纤维素薄膜电泳：纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯制成的薄膜作支持载体凝胶电泳：琼脂糖、聚丙烯酰胺,06-02 平卧式电泳槽装置示意图,06-03 血清蛋白的电泳图谱,平板电泳槽,垂板电泳槽,等电聚焦电泳（isoelectric focusing,IEF),利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。,等电聚焦电泳（isoelectric focusing,IEF),等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。两性电解质：就是在不同PH环境下,电解质可酸性电离,也可碱性电离,如磷酸(二)氢钠,等电聚焦电泳,蛋白质分子在不同pH下的解离状态,NH3+NH3+NH2P P P COOH COO-COO-pHpI pHpI pH pI,H+,OH-,H+,OH-,等电聚焦电泳,等电聚焦电泳具有很高的分辨率，在等电点上只有有0.01pH单位的差异就能准确地分离特别适合分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分特点：,等速电泳(isotachophoresis,ITP),是一种分离组分与电解质一起向前移动，同时进行分离的电泳方法常用于分离小离子、小分子、肽类及蛋白质,等速电泳,采用两种不同浓度的电解质组成，一种前导电解质迁移率高于任何样品组分，充满整个毛细管柱；另一种尾随电解质迁移率低于任何样品组分，置于一端的电泳槽中被分离组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分离等速电泳在毛细管中的电渗流为零,毛细管电泳技术,传统电泳存在的缺陷？不能克服因高电压引起的焦耳热！引发的问题：分离效能低分析时间长,在高压电场下，电解质会产生自热现象，该热量称为焦耳热,毛细管的特点：比表面积大 散热快 可以用很高的电压 分析速度加快 分离效能提高,熔融石英毛细管,毛细管内径,毛细管外径,1.毛细管电泳的工作原理,毛细管电泳是在一根内径为25-75m，长几十厘米熔融石英玻璃毛细管内进行的电泳。是在外加电场的作用下，在毛细管中按荷电粒子淌度或分配系数的差异而进行分离的新技术。,即电泳迁移率,毛细管壁(以熔融石英毛细管柱为例)：pH3时，SiOH+H2O SiO-+H3O+,紧密层,扩散层,剪切面,Zeta电势w,电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。电渗流（electroosmotic flow,EOF)：在毛细管中，溶液中的正电荷与毛细管壁表面的负电荷之间的作用形成双电层，引起流体朝一个方向移动的现象.,EOF,+,-,电渗流的速度、方向A.电渗流淌度：电渗的大小受到电势和介质粘度的影响，一般说来，电势越大，粘度越小，电渗流值越大在不少情况下，电渗流的速度是泳流速度的5一7倍。B.电渗流方向：在通常的熔融石英毛细管区带电泳中，电渗流由正极流向负极.,毛细管电泳中，离子迁移的顺序V总=V+VEOF正离子：电泳方向与电渗流方相同，最先流出；中性粒子：电泳速度为零，随电渗流流出。负离子：电泳方向与电渗流方向相反；VVEOF，无法流出 VVEOF，在中性粒子后流出,+,-,-,N,N,N,N,N,N,N,EOF,都是从负极流出,毛细管电泳仪系统,(一)高压电源,（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；,(二)进样系统,进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小；1.流体力学进样方式（1）进样端加压（2）出口端抽真空（3）虹吸进样,2.电动进样方式：毛细管一端插入样品瓶，加电压；,凝胶电泳进样的唯一方式,(三）缓冲液池,化学惰性，机械稳定性好；(四)检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；,类型 检测限/mol 特点紫外-可见 10-1310-15 加二极管阵列，光谱信息荧光 10-1510-17 灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高，样品需衍生电导 10-1810-19 离子灵敏，需专用的装置,3.高效毛细管电泳仪实图,4.毛细管电泳的分离模式,1 毛细管区带电泳(CZE)2 胶束电动色谱 3 毛细管凝胶电泳(CGE)4 毛细管等速电泳 5 毛细管等电聚焦 6 毛细管电色谱,5.毛细管电泳的临床应用,血清蛋白分析血红蛋白成分分析肌红蛋白分析脂蛋白分析糖化血红蛋白（HbAlc）分析同工酶的分离免疫复合物分析DNA片段和染色分析在治疗药物监测中的应用,b.IgM患者CZE图谱，图中箭头指为异常增值的M蛋白峰；,酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；,采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；,思考题,1、简述毛细管电泳与传统电泳的异同。2、毛细管电泳仪主要组成部分有哪些？3、简述毛细管电泳的基本工作原理和特点。4、电渗流对荷电离子及中性粒子的电泳迁移率有何影响？,
