蛋白质的分离纯化.ppt

,蛋白质的分离纯化,蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,蛋白质的分离纯化方法,透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*丙酮沉淀:低温进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*盐析(salt precipitation)：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。*免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗 该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原 蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质 混合溶液中分离获得抗原蛋白。,电 泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。,几种重要的蛋白质电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：常用于蛋白质分 子量的测定。,等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）,通过蛋白质等电点的差异而分 离蛋白质的电泳方法。pH梯度以两性电解质ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外电场作用下自然形成。,双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis,层析(chromatography),原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,层析的主要设备,常见色谱柱,自动分步收集器,离子交换层析ion exchange chromatography,离子交换层析法是利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。电荷不同的蛋白质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。,离子交换层析法大致分为5个步骤,离子扩散到树脂表面 离子通过树脂扩散到交换位置 在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带 电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不 容易被其它离子取代 被交换的离子扩散到树脂表面 冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中,离子交换层析的原理,凝胶过滤(gel filtration),凝胶过滤色谱亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应，凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸胀后装入色谱柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。,凝胶过滤的作用机制,凝胶过滤的过程,超速离心,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。高速：25000rpm超速：50000-120000rpm,CsCl密度剃度离心,蔗糖密度剃度离心,