蛋白质工程原理及其在食品工业中的应用.ppt

第六章蛋白质工程原理及其在食品加工中的应用,王继刚,第一节 蛋白质工程的原理和方法,以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用基因工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技术。,一、蛋白质工程的概念,天然的正常构象是蛋白质的最佳状态，它既能高效地发挥功能，又便于机体的正常调控，因而极易失活而中止作用。但在生物体外，特别是工业化的粗放生产条件下，这种可被灵敏调节的特性就表现为酶分子性质的极不稳定性，导致难以持续发挥应有的功能，成为限制其推广应用的主要原因。如温度、压力、机械力、重金属、有机溶剂、氧化剂以及极端pH值等都会影响它的作用。,蛋白质工程技术针对这一现状，对天然蛋白质进行改造改良或全新设计模拟，使目的蛋白质具有特殊的结构和性质，能够抵御外界的不良环境，即使在极端恶劣条件下也能继续发挥作用，因而蛋白质工程具有广阔的应用前景。,主要包括：分子遗传学、蛋白质结构功能相关的理论与技术。分子遗传学：完整cDNA的克隆技术、DNA序列的快速测定技术、DNA序列推测蛋白质序列的多维程序系统、原核生物及真核生物基因表达过程的调控、基因的定位诱变及随机诱变理论与技术等。蛋白质结构功能分析：蛋白质一级结构氨基酸序列的分析；X光单晶衍射结构分析技术；两维和三维核磁共振结构分析技术；蛋白质结构数据库的建立；蛋白质功能的酶学和免疫研究技术；蛋白质分子力场、能态、自由能等生物物理学研究技术；计算机模拟处理结构分析系统等。,两大类理论与技术相互关联、相互促进，借助其他多类学科的支持，完成对蛋白质分子结构与功能分析、归类，进一步展开突变蛋白质的分子模拟与预测，实现蛋白质的改造，以及全新蛋白质的分子结构与功能的设计，在计算机模拟的基础上，进行蛋白质分子的化学修饰、合成的实际操作，验证分子设计的结果，获得具有特定结构、性质和功能的目的蛋白质。,蛋白质的生物学功能,1.催化功能：酶2.调节功能：激素3.结构功能：皮、毛、骨、牙、细胞骨架4.运输功能：血红蛋白5.免疫功能：免疫球蛋白6.运动功能：鞭毛、肌肉蛋白7.储藏功能：酪蛋白8.生物膜功能：及神经传导等,由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。,天然蛋白质的合成过程,基因表达（转录和翻译）形成氨基酸序列的多肽链形成具有高级结构的蛋白质行使生物功能,思考：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？,应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。,二、蛋白质工程的原理,（一）蛋白质工程的目的 对目的蛋白质进行结构和功能上的设计与改造，以满足人们特定条件下的需要。以蛋白质结构与功能的研究为基础，掌握蛋白质活性中心的结构，包括催化中心和调节中心的空间构象，了解构成中心的各氨基酸残基及其侧链基团的位置，再借助计算机图像与处理系统的模拟进行分子辅助设计，提出对目的蛋白质的改建或构建方案，确定活性中心的氨基酸残基组成，并辅助设计和预测其结构功能的变化。,（二）蛋白质工程的组成部分 1.蛋白质放大扩增系统 由组织提取的少量纯化的蛋白质，通常只有。作为出发蛋白质分子，先解析部分肽段的一级结构，根据遗传密码设计并合成相应的同位素标记寡聚核苷酸片段，再由此从基因文库中调出该蛋白质的克隆化基因，转入DNA序列分析系统测定DNA序列并克隆化，最后通过表达载体系统扩增蛋白质的量，达到能够分析出发蛋白质的结构功能的水平，通常需要蛋白质量为。,2.蛋白质结构功能分析及分子设计系统 由上一系统获得足量的出发蛋白质后，通过目前已经具备的蛋白质结构分析方法，分析蛋白质的一级结构和空间结构。X光衍射分析晶体蛋白质的结构，而三维核磁共振法研究溶液中的蛋白质结构，同时研究该蛋白质结构与功能的关系，并将结果输入计算机图像处理系统和结构处理系统，根据生物物理学原理以及已知蛋白质结构功能数据库的基本规律，从结构与功能研究出发，进行分子结构分析与模拟，进一步辅助设计和功能预测，提出分子的预期性质、改造或构建方案，完成突变蛋白质的分子设计或构建过程。,3.突变蛋白质的合成表达系统 将突变方案通过分子遗传学方法实施即蛋白质的定点突变技术，改造或构建方案通过合成突变寡聚核苷酸，引入定位突变，或采用其他方法引入突变，并进入克隆系统分离出突变DNA，以此作为模板，引入载体表达系统，扩增表达获得大量的突变蛋白质。对获得的突变蛋白质进行结构、性质和功能的分析、测试与判定，如符合分子设计的要求，则获得目的蛋白质；如不能满足实际要求，则再由分子设计系统重新指导设计，进入新一轮循环，最终获得满足人们要求的目的蛋白质。,（三）蛋白质工程操作中的问题 1.有关分子遗传学和基因工程的问题 例如更有效的cDNA克隆技术，精确高效的定位突变技术，高效目的基因表达系统等。2.有关蛋白质结构功能研究的理论和技术 例如准确地由一级结构推测高级结构，肽链折叠的精确控制，蛋白质的翻译后修饰，蛋白质结构可变性，分子动力学与蛋白质功能的关系，蛋白质在晶体、溶液以及细胞中的不同存在状态及其对蛋白质性质、功能的影响等。3.一些相关辅助技术 例如微量蛋白质的纯化鉴定技术、更有效的蛋白质结晶方法、计算机辅助系统的有效性等。,三、蛋白质工程的基本步骤,1.分离纯化目的蛋白，使之结晶并作X晶体衍射分析，结合核磁共振技术等其他方法的分析结果，得到其空间结果尽可能多的信息。2.对目的蛋白质功能作详细的研究，确定它的功能域。3.通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间相互关系的分析，找出关键的基团和结构。4.围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法实施。5.对经过改造的蛋白质进行功能测定，看看改造的效果如何。6.重复4和5两个步骤，直到获得理想的结果。,蛋白质工程的基本途径,预期的蛋白质功能,设计预期的蛋白质结构,推测应有的氨基酸序列,找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）,讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸,（1）怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。,首先应该根据三联密码子推出mRNA序列，每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出16种。,GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）,mRNA序列,脱氧核苷酸序列,（2）确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？,确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。,蛋白质工程与基因工程的关系,蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。,基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品是该基因编码的天然存在的蛋白质。,蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可分。蛋白质工程根据对分子预先设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对它所编码的蛋白质进行改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的、具有了人类所需要的优点的蛋白质。,蛋白质工程与酶工程的关系,绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。,通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。,蛋白质的结构,蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子的结构密不可分。决定蛋白质这种特殊生物功能的关键因素是它的分子构象。,基本组成单位-氨基酸,组成生物体蛋白质的20种氨基酸,肽（肽键与肽2),肽键就是由氨基酸的-羧基与相邻的氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键,肽（肽键与肽3),肽:氨基酸通过肽键连结起来的化合物二肽:两个氨基酸形成的肽三肽:三个氨基酸形成的肽多肽:许多氨基酸形成的肽蛋白质:大多为100个以上氨基酸组成的多肽,氨基酸残基:多肽链中不完全的氨基酸。氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水，因此表现出其分子的不完整。氨基末端：多肽链中含有自由-氨基的一端。简称N-端羧基末端：多肽链中含有自由-羧基的一端。简称C-端,蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构是指氨基酸按一定的顺序通过肽键相连而成的多肽链，也是蛋白质最基本的结构。每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排列顺序即一级结构，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构，也就是蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构。,蛋白质分子的一级结构,牛胰岛素的一级结构,（1）氢键：氢原子与负电性强的原子（如氧、氮等）间形成。对蛋白质分子三维构象的维护很重要。（2）静电引力：正负带电基团之间的吸引力。对蛋白质分子三维构象的稳定贡献不是很大，也称为离子键或盐键（3）范德华力：原子团相互接近时诱导所致。它变化多样，对维持蛋白质活性中心的构象影响很大,维持蛋白质空间结构的化学键,（4）疏水相互作用：是非极性基团为了避开水相而群集在一起的作用力。疏水作用是维持蛋白质高级结构的重要因素（5）二硫键：作用很强，对稳定蛋白质构象起重要作用氢键、离子键、疏水作用和范德华力等次级键是非共价键肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键,蛋白质二级结构 二级结构是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性结构的构象，是多肽链局部的空间结构（构象）主要形式：-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲等,-转角,蛋白质分子的二级结构,螺旋,折叠片,转角,自由回转,三级结构三级结构是指整条多肽链在二级结构的基础上进一步盘曲而成特定格式的三级结构。四级结构很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立的、具有三级结构的多肽链组成的。这些多肽链之间只是通过疏水作用等次级键结合成为有序排列的特定的空间结构，形成了四级结构。在四级结构的蛋白质分子中，每个具有三级结构的多肽链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，具有完整四级结构的蛋白质分子才有生物活性。,血红蛋白中四亚基两两相同，分别称为1、2、1、2,四、蛋白质工程的主要研究方法,1.蛋白质的分离纯化鉴定方法、结构分析方法、功能研究方法和进行结构改造的分子生物学研究方法 在这四类根据蛋白质工程的操作步骤而划分的主要研究方法中，蛋白质分离纯化鉴定方法与生物化学中的常规方法没有本质的区别，是对许多结构、性质相似的一系列突变蛋白质的分离、纯化和鉴定，但其难度要大得多，通常需要运用多种高精度的方法才能实现，如亲和层析、等电聚焦、免疫沉淀等。,2.蛋白质功能研究方法必须根据不同种类的蛋白质所具有的不同功能，相应地采用不同的研究方法 如对具有催化活性的蛋白质酶，则用酶学的稳态动力学方法；对抗体则用免疫学方法；其他蛋白质如激素、生长因子、受体类以及核酸结合类蛋白质都有相应的研究方法。所有这些蛋白质功能的研究中，建立一套高效、简便的蛋白质功能测定方法是成功的关键。对特定的蛋白质，如果能够找到特异专一性的检测方法，可以极大地提高研究的效率。在分子生物学和蛋白质工程研究中，对不同功能蛋白质特异性检测方法的研究，也是重要的研究方向之一。,（一）蛋白质结构分析方法 蛋白质结构分析方法主要是指与研究蛋白质的空间结构有关的理论与技术。主要包括：蛋白质一级结构（即氨基酸序列）的测定方法、蛋白质晶体学、核磁共振法、蛋白质折叠过程研究、蛋白质生物物理研究法以及蛋白质工程的计算机辅助设计与模拟研究等。1.蛋白质一级结构分析方法 蛋白质一级结构研究，即氨基酸序列的测定，其原理是片段重叠、逐级降解、cDNA以及质谱法等几种，其中片段重叠和逐级降解是最常用的方法。,2.蛋白质构象研究方法 在蛋白质高级结构研究方面，X光衍射和三维核磁共振是蛋白质空间构象研究最主要的分析手段，分别用于对结晶蛋白质和溶液中蛋白质空间构象的研究。X光衍射主要对结晶蛋白质的各向基团的空间排布进行分析，对蛋白质分子的整体空间构架研究作用很大。而三维核磁共振可以直接对水溶液中的蛋白质结构进行分析，溶液中的空间构象更接近于生物体中的自然状态，更能反映蛋白质在执行功能时的实际构象状态。,3.蛋白质折叠过程研究方法 蛋白质折叠过程研究方法，也就是蛋白质折叠机理研究，是蛋白质化学及分子生物学最前沿的课题之一。目前对蛋白质折叠研究主要通过对蛋白质变性、复性过程的热力学和动力学的研究，以及对折叠中间体的研究而进行。变性、复性过程反映了蛋白质中肽链的折叠、卷曲过程。定量地观察、描述和研究蛋白质变性、复性过程，可以研究肽链的折叠过程。热力学研究反映了过程中的能量状态，动力学研究反映了折叠、卷曲过程与时间之间的关系。通过研究折叠中间体来研究折叠途径也是一种常见的方法。,蛋白质从天然状态到变性状态，或从伸展状态折叠到天然构象，是一个渐变过程，其间必然要经过许多中间过渡态，那些较为稳定的过渡态是折叠过程的限速步骤，这种较为稳定的肽链构象称为折叠中间体，它可以有效地反映蛋白质的折叠途径。尽管绝大多数折叠中间体很不稳定，由于三维核磁共振技术的发展，加上氢交换技术及快速混合技术的成熟，已经可以有效地研究这些中间体。,4.蛋白质生物物理研究方法及计算机结构模拟研究 蛋白质的结构研究方法，除了以上的实验方法以外，理论分子生物物理学方法也是重要的途径之一。随着生物物理、化学以及数学学科的发展，特别是分子力学、分子动力学的发展及其与计算机信息处理技术的结合与发展，利用蛋白质分子内部及其周围环境原子之间的作用，以计算机信息处理系统为工具，研究蛋白质的能量、结构、热力学、动力学性质，进行蛋白质空间结构规律研究和预测，取得了突破性的进展。理论分子物理学方法的建立，使蛋白质结构的研究摆脱了必须完全依赖实验过程的传统模式，开辟了利用计算机模拟研究的新思路，推动了蛋白质结构研究的进程。,（二）分子生物学研究方法 基因工程方法，也称分子遗传学方法，是一类涉及遗传物质基因（DNA）的生物学理论与操作技术，包括寡聚核苷酸（又称为寡核苷酸）片段及基因的人工合成、目的基因的克隆与分析、目的基因的定位诱变或随机诱变、目的基因在载体系统中的高效表达等。,1.寡聚核苷酸片段及基因的人工合成 由于DNA自动合成仪的广泛应用，寡聚核苷酸片段及基因的合成，即DNA的化学合成，现已经成为分子生物学及遗传工程、蛋白质工程研究中的常规技术手段之一。无论从合成寡聚核苷酸片段的长度，还是合成的总量来说，都已经达到相当的规模水平。合成的产物DNA片段也有着多方面的用途，除合成全基因或改造基因这一基本用途外，还可用作探针筛选目标基因，作为引物用于基因的定位诱变或聚合酶链式反应（PCR），也可合成连接接头（1inker）用于基因末端改造等，还可以用于研究基因的调控及基因与其他生物大分子的相互作用。,2.目的基因的克隆与分析 应用于蛋白质工程中目的基因的克隆与分析技术，与常规基因工程中的方法没有本质的差别。一般也包含下面几个基本部分：源DNA的获得；DNA片段与克隆载体的体外连接；重组后载体引入宿主复制放大建立克隆基因库；筛选基因库，获得目的基因克隆；目的基因的结构分析。,3.目的基因的定位诱变 定点突变（site-directed mutagenesis）技术是对已知DNA序列的基因或基因片段中任意指定位置进行突变的技术。它可以按照人们的意愿在指定的位置实现核苷酸的取代、插入或缺失。优点：比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的优点，在蛋白质工程中主要应用于需要改变的氨基酸残基位置可以预先确定的情况下。目前常用的定点突变方法：寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变和盒式突变。,（1）寡核苷酸引物介导的定点突变 原理：用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制，将引物中的突变引入到基因中（图）。步骤：将待突变基因克隆到突变载体上。制备含突变基因的单链模板。引物与模板退火5端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA。合成突变链，在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全民的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的DNA分子。转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因。对突变体基因进行序列分析。,缺点：常常会产生突变效率较低的现象，主要原因是大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统所致。进展：近年来这一方法已有了许多改进，如尿嘧啶取代法、缺口双链DNA法、双引物法等均是利用对大肠杆菌碱基错配修复系统的抗性来提高突变率的。另外也有人采用改进的质粒作为载体，省去了单链模板的制备步骤，节省了时间。,（2）PCR介导的定点突变法及其改进大引物突变法 见书（3）盒式突变 原理：利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成，当它们退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体，突变效率很高。优点：如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数，这对于确定蛋白质分子中不同位点氨基酸的作用是非常有用的方法。特别是对蛋白质中的指定位置的氨基酸残基，进行一系列不同氨基酸残基取代以考察取代效果时，非常有效。,目的基因的定位诱变，与随机诱变一起都是体外基因诱变最常用的方法。定位诱变法对结构比较清楚的基因或蛋白质较为适合，随机诱变法则对了解较少的基因或蛋白质比较适用。随机诱变法不但对研究对象的基本性质要求较少，还能反过来帮助分析基因或蛋白质的结构，由此思路发展成分子进化工程技术，大大加快了对生物大分子人工改造的进程。,4.目的基因的高效表达系统 目的基因表达系统中，以大肠杆菌（E.coli）系统最为常用，许多原核和真核生物的基因均能在这一系统中实现高效表达。酵母表达系统是真核生物常见的表达系统，除此之外，还有枯草杆菌系统以及高等真核细胞外源基因表达系统等。在分子生物学方法中出现了一种全新的引入突变的方法，称为tRNA介导蛋白质工程，它是在目的基因表达过程中引入突变的方法。该方法是借助校正tRNA定点掺入非天然氨基酸，以提供蛋白质结构信息，改进蛋白质检测与分离方法，甚至赋予蛋白质某些新的特性。,蛋白质的体外定向进化 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。方法：DNA重组（DNA Shuffling）、易错PCR、随机定位突变等,融合蛋白技术 为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。双功能酶（多功能酶）以往研究发现，在利用基因融合所构建的大的酶分子中，如果用以构成融合蛋白的各个酶分子的整个编码序列均保留于新的酶分子中，则融合蛋白一般均保留所构成的酶分子各自的酶活性。定向药物 定向药物一般由两部分组成：一部分是药物；另一部分是可以与病灶特异性结合的配基。通过融合蛋白技术将这两部分融合在一起，即可构成一个具有独特构象与功能的蛋白质。,五、蛋白质工程的意义与展望,作为第二代遗传工程，蛋白质工程研究为当代生物技术的产业化发展注入了新的生命力。它已经在蛋白质药物改造、酶工程、抗体工程、分子电子器件和新型医学生物材料研制中获得越来越广泛的应用。已成功地设计并合成了以-螺旋和-折叠层为主体的简单蛋白质，跨出了人工构建蛋白质的第一步。同时蛋白质工程正在推动一个从预定生物功能到期望的蛋白质结构，再到编码基因及其表达的反向生物学的发展。,21世纪初的20年间蛋白质工程将处于迅速发展时期，一方面，研究方法和技术将日臻成熟；另一方面，通过与基因工程的密切结合，可望获得一些有应用价值的成果。但作为以改造通过长期自然进化产生的蛋白质为目标的高新技术，蛋白质工程在实用上尚有一系列严重困难有待研究解决，在产业化的方向上将有艰难的历程。蛋白质工程是希望与挑战并存、艰辛与硕果同在的崭新研究领域。,蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景。,提高蛋白的稳定性包括以下几个方面：延长酶的半衰期；提高酶的热稳定性；延长药用蛋白的保存期；抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。,第二节 蛋白质工程与食品加工,引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性,溶菌酶分子：由一条肽链构成，并在空间上折叠形成二个相对独立的结构域，酶活性中心位于二个结构域之间。该酶分子在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸由于二硫键是一种稳定蛋白质分子空间结构的重要共价化学键，有如建筑所用的钢筋一样，因而能将分子中的不同部位牢固地联结在一起。因此，提高酶热稳定性最常用的办法是在分子中增加一对或数对二硫键。,在高温下Asn和Gln容易脱氨形成Asp和Glu，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有2个Asn，由于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第14位和第78位上的2个Asn分别转变成Thr(苏氨酸)和Ile(异亮氨酸)残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。,转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性,提高酶的催化活性,酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定如对酪氨酸-tRNA合成酶进行定点突变在天然状态下，酪氨酸-tRNA合成酶分子内第51位苏氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上的氧原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物ATP的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第51位苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶(Pro-51)与ATP的亲和力被增加了近100倍，而且最大反应速度亦大幅度提高。,葡萄糖异构酶（GI），1957年最早在嗜水假单胞菌中发现其活性，后来又发现近百种细菌和放线菌能合成该酶，其中绝大多数为胞内酶，只有极少数菌株能分泌胞外酶。葡萄糖异构酶能将D-葡萄糖、D-木糖和D-核糖等催化为相应的酮糖。在体外一定条件下，它也能催化D-葡萄糖转化为果糖，因而成为工业上制备高果糖浆（HFCS）的关键酶；它还可用于含木聚糖类物质发酵生产乙醇，是一种具有重大经济价值的工业用酶。,一、葡萄糖异构酶（）,1967年美国成功地进行了GI的工业化应用，以后西方国家主要的淀粉加工业都转向GI技术生产。各国又竞相利用生物高技术改造GI的结构、性质和功能，以提高该酶的适应性，扩大应用领域。由于葡萄糖异构酶有较好的耐热性，结构也较稳定，使它成为目前国际上公认的研究蛋白质结构与功能关系，建立完整蛋白质工程技术的最好模型之一。,（一）葡萄糖异构酶的基本性质 葡萄糖异构酶能催化D-葡萄糖异构化生成D-果糖，也可将木聚糖异构化为木酮糖，此外还能以D-核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖及葡萄糖3、5、6碳的修饰衍生物为催化底物，但是它只能催化D-葡萄糖或D-木糖的-旋光异构体，而不能催化-旋光异构体。葡萄糖异构酶的最适温度一般在70-80，最适，微偏碱性，不同种属来源的酶有一定的差别。葡萄糖异构酶的最适温度、最适pH值及稳定性还受到缓冲液种类、底物浓度、激活剂、稳定剂及反应时间的影响。另外二价金属离子对酶活力、稳定性及酶的专一性都有影响。,各种属来源的葡萄糖异构酶在结构上都有一定的相似性。其一级结构的同源性随种属关系远近不同而不同。但有40个恒定氨基酸残基，其中包括14个残基与酶活性中心有关。葡萄糖异构酶晶体的空间结构一般都是紧密的四聚体，单体相对分子质量约4万-5万，单体间符合222点对称分布。单体由一大一小两个结构域构成，近N端的主结构域是由8股右手的/型桶构成，两个同轴圆柱中，内柱由8条平行的-折叠股构成，外柱由8股与-折叠交替相邻-的螺旋构成,-螺旋与-折叠构成反平行；C端的小结构域由几段-螺旋无规则卷曲成一个远离N端的环状结构，参与单体内的相互作用及活性部位的构成（图）。,葡萄糖异构酶的活性中心位于每个单体平行桶近C端的口部，是深陷的口袋状，有两个二价金属离子结合位点，与保守的氨基酸残基侧链基团以及溶剂中的氧原子形成配位键，周围有一个高度疏水背景区，构成的氨基酸侧链不只由一个单体提供，两个单体相聚成无活性或活性微弱的二聚体，只有形成四聚体时才具有全部酶活。葡萄糖异构酶的催化作用采用的是金属离子介导的负氢离子转移机制（图）。葡萄糖异构酶的基因组织和调控主要是由木糖操纵子控制。由木糖透性酶基因（xylt）、木糖异构酶基因（xyla）、木糖激酶基因（xylb）和调节基因（xylr）构成木糖操纵子的主要成分。,葡萄糖异构酶最适pH为碱性，在80稳定，而在碱性条件下，80时使高果糖浆焦化产生有害物质，反应只能在60进行。采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的区域置换为碱性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖异构酶的最适pH值变为酸性，即可在高温下进行反应,（二）葡萄糖异构酶的蛋白质工程 直接发酵生产的GI应用在工业生产中，已经取得了令人瞩目的成功，但仍存在一定局限性，如最适pH值为碱性、高温下稳定性还有待提高等。偏碱性条件下糖不稳定易焦化，使总产率下降；高温条件有利于反应进程的加快和平衡点的向果糖方向移动，因此对GI进行定向改造成为客观迫切的需求，而蛋白质工程技术，可在研究GI结构功能关系的基础上，通过对某些氨基酸的替代和修饰，改变GI的结构性质，改善其工业应用性能。,表6-1 SM1033葡萄糖异构酶定点突变及其性质,通过分析比较已知的其他种属GI氨基酸序列发现，除高温嗜热菌外，该同源位置氨基酸均为Gly，而嗜热高温菌同源性部位则为Pro，恰恰是它的热稳定性和最适反应温度都是最高。Pro较小的转动自由度以及刚性的吡咯烷环使得-转角或无规卷曲结构更加稳定，从而稳定整个蛋白质的空间结构，提高蛋白质的热稳定性。这一现象在其他多种酶中都能发现，如1,6-寡葡糖苷酶、Trp合成酶、鸡腺苷酸激酶等。在蛋白质工程中，用Pro替代其他氨基酸（X-aaPro）也有许多应用，如T4噬菌体溶菌酶、丝氨酸蛋白水解酶、中性蛋白酶等。,葡萄糖异构酶的定点突变蛋白质工程对酶的专一性也有影响，表6-2列出了一些突变体酶对葡萄糖和木糖的催化常数。由表中可见野生型的GI对木糖的催化作用比对葡萄糖大，不同的突变酶其酶的选择性不同，双突变W139FV186T和W139FV186S的酶底物专一性均有利于葡萄糖的异构化反应。,表6-2 定点突变对GI底物专一性的影响,二、凝乳酶,凝乳酶（chymosin）是利用生物工程技术发酵生产的食品工业用酶之一，早在1990年就已获美国FDA批准用于干酪生产，且符合GRAS（Generally Recognized as Safe）标准，无需标示。凝乳酶也是研究蛋白质结构修饰与功能之间关系的良好材料。凝乳酶的蛋白质工程主要集中在对二硫键的研究上。不同来源的凝乳酶有不同数目的二硫键。牛凝乳酶含有三对，米黑毛霉含有两列，寄生内座壳菌只有一对。因此不同二硫键在凝乳酶中对酶活性的影响是不同的，利用蛋白质工程中的定点突变技术可以了解二硫键在结构、功能中的作用。,三、其他分子蛋白质工程,（一）胰岛素的蛋白质工程 胰岛素是一种蛋白质激素，是治疗糖尿病的特效药，具有重要医用价值。天然胰岛素用于临床有一些重要缺点，包括作用时效短、进入血流缓慢、长期使用产生抗性、长期保存易变性、供应短缺等。通过对胰岛素的蛋白质工程研究，可以获得上列缺点得到改善的新型胰岛素制剂。我国的相关研究人员密切合作，取得下列一系列研究结果。,1.改造胰岛素原连接肽（C肽），从30几个氨基酸缩短为3个氨基酸，获得基因工程生产胰岛素的高效表达，已进入中试，并获得国家专利。2.依据药用胰岛素制剂的精细结构，提出增加次级键、稳化寡聚体以获得长效胰岛素的原理，通过定向分子设计获得2种目标产品，作用时效延长8-12h。在0.2nm分辨率测定目标产品的晶体结构，证实分子设计原理的正确性。首次在国内成功地实现从预定性能分子设计目标产品制备改性产品的结构测定的蛋白质工程全循环，为进一步的研究奠定了基础，提供了经验。,3.以速效和高效胰岛素为中心，完成定向分子设计12种，获得4种目标产品，成功地达到预期目标。4.建立了工程化胰岛索结构一功能研究的多种系列，包括长效、速效、高效、高稳定、低免疫等改性胰岛素，形成了一个比较系统的多方位研究格局，为我国胰岛素蛋白质工程的进一步发展、创新和临床应用提供了充分条件。,（二）胰蛋白酶抑制剂 通过蛋白质工程途径研究慈姑双头蛋白酶抑制剂和南瓜族的天花粉蛋白酶抑制剂的结构与功能，取得显著成绩。1.确认抑制剂的活性中心和二硫键的作用。2.改变抑制剂的专一性，确认专一性相关残基。,（三）枯草杆菌蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶是广泛用于洗涤剂工业中的一种重要酶。蛋白质工程的主要目的是通过酶分子改造获得抗氧化、稳定性并能高表达的碱性蛋白酶。经过几年的努力，已获得很好的结果。1.用定点诱变方法先后通过突变Met222Ala、Gln103Arg、Asp60Asn，使碱性蛋白酶抗氧化性达到95%以上，并提高酶的比活2-3倍。,2.用PCR法对蛋白酶基因进行随机突变，通过表型筛选得到热稳定的碱性蛋白酶，热失活半衰期比野生型延长3-6倍。在65的高温下，半失活时间长达82min。由此获得了既抗氧化又耐热的碱性蛋白酶。热稳定的碱性蛋白酶基因的DNA序列测定发现，突变Asn118Ser是热稳定性增加的主要原因，这一结果迄今尚未见有报道。这不仅对该酶应用范围的扩大具有意义，而且对其结构一功能关系提供了新的了解。这一研究结果已经获得国家专利。,（四）天花粉蛋白的蛋白质工程 天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）是从括楼块根中分离纯化的一种活性蛋白，属型核糖体失活蛋白。TCS最早用于中期引产，对治疗恶性葡萄胎、滋养层细胞疾病等有较好疗效。它还有广谱的抗病毒作用，能抑制人艾滋病病毒（HIV-1）在受感染细胞中的复制，可望用作抗艾滋病药物。但天花粉蛋白作为外源毒蛋白，在体内引起免疫应答，导致过敏反应。蛋白质工程试图通过对TCS进行结构与功能的改造，降低TCS的免疫原性。,已经通过测定突变体蛋白与单抗TET结合能力的改变，发现在残基173-177之间的突变体明显降低了与单抗TET的结合能力，从而推测173-177位残基附近可能是单抗TET的结合部位。同时，对于活性部位附近具有恒定氢键并在一级结构上保守的残基进行了定位诱变试验，以了解它们对活性部位构象及生物活性的影响，对这些突变体生物活性及酶动力学测试表明，它们与野生型相比变化不大。对突变体Q156A和R22L的晶体结构测定显示，虽然突变残基与天然残基显著不同，但TCS分子活性部位的构象基本上保持不变。这为进一步的分子设计提供了参考信息，即某些活性部位的保守残基也是可替换的。,（五）溶菌酶 溶菌酶的蛋白质工程主要应用于“工程二硫键”提高该酶的热稳定性方面，以T4溶菌酶的研究较为深入。晶体结构研究表明，T4溶菌酶分子含一条肽链，并折叠形成两个在空间上相对独立的结构域，活性中心位于两个结构域之间。该分子含97位和54位两个未形成二硫键的半胱氨酸，即野生型酶不含二硫键。二硫键是稳定分子空间结构最重要的一种共价键，它能将分子牢固的联接在一起，因此它能提高酶的热稳定性。Perry对溶菌酶空间结构仔细分析并提出对其热稳定性改善设计方案。采取通过定位突变，使溶菌酶半衰期由原来11min提高到6h。如果同时用碘乙酸封闭余下的第54位Cys或将其突变为Thr或Val，则同时提高该酶的抗氧化活力。新引入的“工程二硫键”稳定了两个结构域的相对位置，从而稳定了由两个结构域所形成的活性中心。,六、修饰酶的催化特异性 利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代时，突变体酶分解-1，4糖苷键和-1，4糖苷键的活性比例发生明显改变,七、修饰Nisin的生物防腐效应 Nisin是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子肽，可用于罐头食品、乳制品、肉制品的保藏Nisin由34个氨基酸残基构成,改变Nisin氨基酸的序列，可增强其稳定性、溶解度和扩大抑菌谱等，扩大Nisin的应用范围。,Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸，即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA，它们通过硫醚键形成五个内环。,食品蛋白质功能特性改善是目前该领域研究热点，改性方法包括物理、化学和酶法改性等。从分子水平看，改性实质是切断蛋白质分子中主链或是对蛋白质分子侧链基团进行修饰，从而引发蛋白空间结构和理化性质改变，使蛋白功能特性和营养特性得到改善。其中化学改性和酶法改性是研究、应用较多改性方法，化学改性具有简单、应用广泛和效果显著特点。,食物蛋白质改性技术,食品蛋白质功能特性系指对人们所期望食品特征产生影响那些物理化学性质，它对于食品或食品成分在制造、加工或保藏中物理性质起着重要作用。蛋白质功能性质包括以下几个方面:(l)水合特性，取决于蛋白质与水的相互作用，如溶解性，持水性，粘度等;(2)表面性质，主要包括蛋白质乳化性和起泡性等;(3)蛋白质与蛋白质相互作用，体现在蛋白质凝胶作用和成膜性等。,1、物理改性组织化挤压、高静压改性、高热高压均质改性、超声改性、高频电场改性以及微波改性等。2、化学改性（1）碱处理（2）酸处理（3）琥珀酰化作用（4）乙酰化作用（5）磷酸化作用（6）酰胺化作用（7）硫醇化作用（8）酯化作用（9）糖酰化作用（10）去酰胺基作用,蛋白质化学改性主要是对其多肤中一些氨基（-NH2）、轻基（-OH）、琉基（-SH)以及羧基（-COOH)进行改性，从而起到改善其各项功能特性，包括溶解性、表面性质、吸水性、凝胶性及热稳定性等。其实质是通过改变蛋白质的结构、静电荷、疏水基团，从而改变其功能性质。食品蛋白质化学改性方法，包括酰化、脱酰胺、磷酸化、糖基化(即美拉德反应)、共价交联、水解及氧化等方法。,3、酶法改性 酶法水解改性 酶法聚合改性4、化学-酶改性作用5、化学改性及酶法改性限制因素（如何消除苦味？）,（六）蛋白质分子设计及其新方法研究 我国在研究和发展蛋白质分子设计及其定量方法方面，取得了一系列具有创新意义的成果：1.酶与底物、药物与受体结合自由能及稳定性的计算机模拟。2.蛋白质及其周围溶剂的静电相互作用的计算机模拟。3.多肽及蛋白质的随机动力学模拟。,