蛋白质分离技术.ppt

第十节,蛋白质的分离与纯化,一、引言二、蛋白质（酶）分离纯化的前处理三、蛋白质（酶）分离与纯化四、层析技术五、电泳技术六、离心技术,四、层析技术,层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现薄层层析、气相层析、高压液相层析、亲和层析、凝胶层析等。,（一）层析的分类,按层析的分离机理分类排阻层析(exclusion chromatography)离子交换层析(ion exchange chromatography)吸附层析(absorption chromatography)分配层析(partition chromatography)亲和层析(affinity chromatography)金属螯合层析(metal chelating chromatography)疏水层析(hydrophobic chromatography)反向层析(reverse phase chromatography)聚焦层析(focusing chromatography)灌注层析(perfusion chromatography),（二）排阻层析（凝胶层析）,凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。用于层析的分离介质称为排阻层析介质。凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药的研究和生产中必不可少的分离介质。,1、凝胶层析的特点及应用,特点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点。用途：蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。,2、凝胶层析的原理,凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。,3.凝胶的种类和性质,(1)交联葡聚糖凝胶（Sephadex)1)Sephadex G G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。2）SephadeX LH20，是Sephadex G25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。(2)琼脂糖凝胶（Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。(3)聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶P（Bio-Gel P).(4)聚丙乙烯凝胶（Styrogel)大网孔结构。,葡聚糖凝胶(Sephadex)的物理特性,4.层析柱的重要参数,柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示。外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。,内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。不包括固体支持物的体积（Vg）。峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve 表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。,5.凝胶过滤在试验室中的应用,1）生物大分子物质的分离纯化2）分子量的测定3）分级分离4）溶液浓缩5）平衡常数的测定6）细胞及颗粒的分离,6.分子量的测定,蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:,LogM=k1-k2Ve,（Ve为洗脱体积）,先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。,（三）离子交换层析,根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团。含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出H+；含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出OH-。,1.离子交换层析的原理,生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不同的分子大小及电荷排列方式。当在一定pH下净电荷为负的蛋白质分子可通过静电键结合到带正电荷的阴离子交换剂上；当在一定pH下净电荷为正的蛋白质分子可通过静电键结合到带负电荷的阳离子交换剂上；大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来。,2.离子交换层析的应用,1)水处理 离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各种离子的方法，聚丙乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。2)分离纯化小分子物质 离子交换层析广泛应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH值为23上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的离子强度和pH值，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。全自动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成。,3)分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法结合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。,（四）吸附层析(absorption chromatography),吸附作用是指某些物质能够从溶液中将溶质浓集在其表面的现象。利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。固定相为固体，流动相为液体。,物质之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子和固体内部分子所受的吸引力不同。在固体内部，分子之间互相作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表明的分子所收的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡和不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。,实验中常用的固体吸附剂有氧化铝、硅酸镁、磷酸钙、氢氧化钙、活性钙、蔗糖、纤维素和淀粉。常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水与有机溶剂形成的各种混合物。吸附层析通常用于分离脂类、类固醇类、类胡罗卜素、叶绿素以及它们的前体等非极性和极性不强的有机物。,（五）分配层析(partition chromatography),分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的层析技术，相当于一种连续性的溶剂抽提方法。在分配层析中，固定相是极性溶剂（例如水、稀硫酸、甲醇等）。此类溶剂能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸等)紧密结合，使呈不流动状态；流动相则是非极性的有机溶剂。,分配系数()是指在一定温度和压力条件下达到平衡，物质在固定相和流动相两部分的浓度比值。,在层析过程中，当有机溶剂流动相流经样品点时，样品中的溶质便按其分配系数部分地转入流动相向前移动。当经过前方固定相时，流动相中的溶质就会进行分配，一部分进入固定相。通过这样不断进行的流动和再分配，溶质沿着流动方向不断前进。各种溶质由于分配系数不同，向前移动的速度也各不相同。分配系数较大的物质，由于分配在固定相多些，分配在流动相少些，溶质移动较慢；而分配系数较小的物质，流动速度较快。从而将分配系数不同的物质分离开来。,（六）亲和层析(Affinity Chromatography),许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性。例如：酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等），抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体），核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）以及细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。,1.亲和层析的原理,亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,2.亲和层析的特点,纯化效率极高：亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的效率极高，提纯度可达几千倍。,3.亲和层析的应用,1）抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数为108-1012 M，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。,2)激素和受体蛋白 激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力（10-61012 M）而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。,3)凝集素和糖蛋白 凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。伴刀豆球蛋白A能结合含-D-吡喃甘露糖苷或-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。,4）多核苷酸和核酸 利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。5）辅酶 核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。,6）分离病毒、细胞 利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。,（七）金属螯合层析(metal chelating chromatography),利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。,金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的分离,（八）高效液相色谱（HPLC）,高效液相色谱法是以液体作为流动相，用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。,1.高效液相色谱法的特点,特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,2.液相色谱仪、主要部件及流程,主要部件,(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。,(2)梯度淋洗装置,外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,(3)进样装置,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,(4)高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,(5)高效液相色谱检测器,紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9gmL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的检测器。,光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,3.影响分离的因素,影响分离的主要因素有:固定相及分离柱；流动相的流量、性质和极性;,1）固定相及分离柱,选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。,2）流动相及流动相的极性,（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,流动相组成,流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,4.高效液相色谱法的主要分离类型,1）吸附色谱（液-固吸附色谱）以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2）分配色谱（液-液分配色谱）早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。,3）离子交换色谱 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4）凝胶色谱（空间排阻色谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；,五、电泳技术,电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。,电泳技术发展简史,1809年俄国物理学家首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。,1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。,1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。50多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视和应用。,（一）电泳的分类,原则上按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质,（二）电泳的基本原理,电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。,若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：F引=E Q（1）在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6rV 当F引=F阻时 EQ=6rV V=由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度()成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。,EQ,6r,（2）,（3）,（4）,由（4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同。在一次电泳中，蛋白质处在同一电场中，为了便于比较，常用迁移率 m（或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。m=V/E=Q/6r（5）由上式可以看出，在同一电场中，迁移率仅与球形粒子所带电荷数量、粒子大小及溶液粘度有关，而与电场强度无关。,EQ,6r,（4）,V=,以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有效迁移率还受电渗（是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响。电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。最后要考虑选用离子强度适宜的溶液。离子强度影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快。总之，电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、pH、电渗及离子强度多种因素的影响。,（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型。,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,1.聚丙烯酰胺凝胶的制备,聚丙烯酰胺凝胶聚合为自由基聚合，其催化体系有两种：1.化学聚合 化学聚合的催化剂（引发剂）通常采用过硫酸铵（ammonium persulfate，Ap），此外还需要加速剂TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可促使过硫酸铵形成自由基：S2O82-2SO4-这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。,2.光聚合,光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。上述聚合反应受许多因素的影响：（1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。（2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。,2.凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交联度（C）的计算公式分别为：,凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为5%时，凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大。,在浓度为7.5%的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5%凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10%的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖，或在3%凝胶中加入20%蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。,3.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面：1）凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶（23），下层为小孔径的分离胶（515）。2）缓冲液离子组成的不连续性。主要是阴离子不同（Gly-,Cl-）。3）凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9 的Tris-HCl缓冲液。4）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。,Tris-Gly pH=8.3,Tris-Gly pH=8.3,Tris-HCl pH=6.8T=3%,Tris-HCl pH=8.9T=7.5%,4.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。,SDS的作用原理,这种阴离子去污剂能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分子部、分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的空间构象。当SDS的总量为蛋白量的310倍且SDS单位浓度大于1mol./L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷符号的差异。且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。,不同蛋白质的SDS复合物形状相似，均是长椭球状。在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关。m=V/E=Q/6r 令：Q/=C 则：m=V/E=C/6r在SDS-电泳中，蛋白质的泳动度与其大小成反比,测定蛋白质分子量,当蛋白质的分子量在17,000165,000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=lgKbm MW为蛋白质的分子量，m为相对迁移率，K为常数，b为斜率 将已知分子量的标准蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。,5.聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，IEF-PAGE),聚丙烯酰胺凝胶中加入一种合成的两性电解质载体，在电场的作用下会自发形成一个连续的pH梯度。蛋白质样品在电泳中被分离，运动到等电点胶层时就失去所带电荷而稳定停留在该处，样品中不同蛋白质组分等电点不同，因而在等电聚焦电泳中得到有效分离。在等电聚焦电泳中，利用各蛋白质组分等电点的差异，并不利用凝胶的分子筛作用。它的分辨力高，可分离等电点相差0.010.02pH单位的蛋白质。,载体两性电解质商品有ampholine(LKB公司)、Pharmlyte(Pharmacia)、Serralyte(Serva)以及国产的Ampholine(上海生化所东风厂生产)。Ampholine是具有多等电点的多氨基多羧基酸类化合物。,随机加成,多胺同系物,丙烯酸,加成度不同的混合物，分子量大小不同，胺基和羧基的比例不同。,载体两性电解质及对应的电极缓冲液,主要理化性质为：缓冲性能强 Ampholine溶液在一定PH范围内有充分的缓冲能力，当蛋白质进入与其等电点相应的PH区域时，PH值并无变化；导电性能好 Ampholine溶液有均衡的电场强度，但是在PH等于中性的区域导电性能较差。因此在应用时，不管选择什么PH范围，一般都要加入其总量1/10的PH68的Ampholine溶液，以保持电场强度的均匀性；分子量小 Ampholine一般分子量都在3001000之间。一便用分子筛或透析等方法将它与被分离的高分子物质分开；紫外吸收值低 Ampholine对于在280nm处测定蛋白质吸收值的干扰小，但是如果蛋白质浓度低，Ampholine用量又高，则往往干扰较明显，严重时应进行矫正；一般与样品不起化学反应。,pH梯度形成的机制,载体两性电解质既有酸性基团(NH2)，也有碱性基团(COO)，既可接受质子，也可释放质子。在溶液中的两性电解质一方面受溶液pH值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境（水溶液），使其pH值有所改变。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。电泳时凝胶板正极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠。正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于pI的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳时，向负极泳动的速度也就因此不同。负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，以不同速度向正极泳动。在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的pH。当达到平衡时，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的pI区域，不在移动。所以，溶液也因此呈现不同的pH，随载体两性电解质的pI梯度而形成pH梯度。,(1)靠近阳极端的载体两性电解质,电负性最强,具有较强的缓冲氢离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阴极顺延;(2)靠近阴极端的载体两性电解质,电正性最强,具有较强的缓冲氢氧根离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阳极顺延。,pH 3,pH 10,pH 7,NaOH,H3PO4,6.双向电泳（two-dimensional electrophoresis）,如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳。双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。单向SDSPAGE电泳分辨力差，仅能分开50左右种的蛋白；IEF-PAGE分辨力稍高，也只能分开100多种蛋白质；双向电泳可分辨1000种以上的蛋白质，一般为200015000种。,（四）毛细管电泳,定义：毛细管电泳是在散热效率极高的、空芯的、微小内径（10-200m）的毛细管内进行的大、小分子高效分离技术。,2.毛细管电泳仪基本结构图,毛细管：长：47cm,57cm,67cm;直径：5-200 m,进样系统：气压进样、电压进样。,冷却系统:液冷、风冷。,高压系统:1-30kV。,毛细管电泳的检测器：紫外检测器、二极管阵列检测器、激光诱发荧光检测器、电化学检测器、质量（质谱）检测器等。,PRINCE 700毛细管电泳仪,CEC-加压毛细管电色谱,3.毛细管电泳的分类,1、毛细管区带电泳（CZE）2、分子体积排除（筛滤）电泳或 凝胶电泳（CGE）3、等电聚焦电泳（IEF）4、胶束电动力学电泳（MECC）5、等速聚焦电泳（ITP）,4.毛细管电泳的主要优点,1、高灵敏度2、高分辨3、速度快4、进样少5、成本低,高灵敏度：紫外检测器的检测极限在10-1310-15mol之间，荧光检测可达10-1910-21mol,高分辨：峰分离效率超过1百万理论塔板数，一般可达几十万。,速度快：许多分析在10分钟内完成。,进样少：一般需要毫微升的进样量。,成本低：一般只需要可长期使用的毛细管和极微量的可自己配制的缓冲液。,5.毛细管电泳的应用领域,小型离子 小分子 肽类 蛋白质 低聚核苷酸 DNA,毛细管电泳的应用选择,小型离子 小分子 肽类 蛋白质 低聚核苷酸 DNA CZE MECC CZE CZE CGE CGE ITP CZE MECC CGE MECC ITP IEF IEF CGE ITP ITP,