蛋白质(或多肽)的放射性标记及分析方法.ppt

第二部分 核素示踪技术在分子生物学研究中的应用,分子生物学是一门新兴边缘学科，它跨越了遗传学、细胞生物学、有机与无机化学、生物化学、物理学、生物物理学等许多学科，是当代数、理、化科学广泛深刻地渗入生物学而形成发展起来的。其中，核素示踪技术在其中起着里程碑性的重要作用。一、35S和32P双标记噬菌体感染实验证明DNA是遗传信息的载体1952年，Hershey和Chase用大肠杆菌的T2噬菌体繁殖实验，证实了从噬菌体颗粒注入到细菌中去的DNA含有繁殖后代噬菌体所需的全部信息。T2噬菌体颗粒由蛋白质外壳包裹的DNA(单链)核所组成。在DNA核与蛋白质外壳中，只有DNA含有磷原子，只有蛋白质中的甲硫氨酸和半胱氨酸含有硫原子，把T2噬菌体放在以放射性磷(32PO43)为唯一磷源和以放射性硫(35SO42)为唯一硫源的培养基中培养时，即可获得32P标记的DNA和35S标记的蛋白质的噬菌体。用这种双标记的噬菌体去感染大肠杆菌寄主，结果发现只有32P标记的DNA注入到寄主细胞内部并繁殖出具有蛋白外壳的子代噬菌体。在这些子代噬菌体中，有少量的DNA带有标记32P，但没有一个蛋白外壳带有标记35S。证实了DNA是遗传信息的携带者。,二、15N,14N标记E.Coli繁殖实验证明双链DNA具有半保留的复制机制 1957年，Meselson-Stahl用放射性标记技术，实验证明了Watson与Crick提出的双链DNA半保留复制理论。在半保留复制中，亲本双链DNA的两条链分开，它们根据碱基配对原则各自以自己为模板，选取适当的碱基组成两条子代双链，完成复制过程。实验是这样进行的：先使细菌培养物(EColi)在以15N标记的15NH4C1为唯一氮源的培养基中生长许多代，使DNA分子都标记上重同位素15N。再把细胞转移到含普通同位素15N的培养基上。在转移后不同时间收集细胞样品，提取DNA并作CsCl密度梯度离心。结果发现有密度介于重的15N，14N和轻的15N，14N DNA之间的杂化分子15N，14N DNA出现。这种杂化分子随着培养时间的增加逐渐增多。当培养到ECo1i繁殖第一代的时间时，杂化分子成为主要成分。尔后即有轻的15N，14N DNA分子出现。当培养到EColi第二代时，杂化DNA与轻DNA各占一半。取杂化DNA分子在100下作热变性处理后于CsCl中离心，可以出现两条区带，它们分别为14N单链DNA和15N单链DNA。Meselson-Stahl实验证实了E.Coli繁殖中，亲代DNA分为两条单链，各自成为子代双链DNA的模板，双链DNA具有半保留复制机制。,三、32P标记分子杂交实验证明遗传信息从DNA到mRNA的转录 Spiegelman利用人工合成RNA-DNA杂种分子的实验证明RNA分子的核苷酸顺序由DNA转录决定，RNA分子的生物信息来自DNA。把双链DNA加热，使产生单链DNA分子，若在热溶液逐渐冷却过程中加入与该DNA链互补的单链mRNA，则在形成复性DNA分子的同时会有DNA-RNA杂种分子形成。形成杂种分子的条件是这种RNA分子的核苷酸顺序与DNA分子中某些核苷酸顺序互补。利用这个原理，可以鉴别RNA与DNA碱基顺序是否有互补的特性。实验也可采用放射性标记技术进行。将T4噬菌体感染的大肠杆菌(EColi)放在含32PO43的培养基中培养，提取32P标记的RNA，将32P-RNA分别加到EColi的DNA热溶液和T4噬菌体的DNA热溶液中，溶液慢慢冷却后上膜过滤，除去游离RNA，测量膜上物质的32P放射性活度。结果发现加到T4 DNA溶液中的32P-RNA大部分已和T4 DNA形成杂交分子并留在膜上，而加到EColi DNA溶液中的32P-RNA很少与EColi DNA形成杂交分子因此很少留在膜上。这个实验证明了感染后合成的RNA和噬菌体DNA的碱基顺序互补，前者的碱基顺序由后者决定，同时感染后合成的RNA并下与宿主细胞DNA互补。这个结果和关于噬菌体DNA是合成噬菌体mRNA的模板这一早期推测完全一致。,四、3H-亮氨酸标记网织红血球培养实验证明多肽链合成起始于氨基末端 多肽链是从氨基末端还是从羧基末端开始延伸的，Dintzis的放射性标记实验作出了回答。把网织红血球加3H标记的亮氨酸3H-Leu作体外培养，蛋白质合成后分离提取出新合成的血红蛋白，分析该蛋白肽链中的放射性分布。实际上，如果培养的时间相对较长时(如3min)，那么在合成的肽链中，有一些是在加入3H-Leu前已接近完全合成的，这些肽链中只在远离生长点的地方有3H-Leu；另一些肽链是在加入3H-Leu后才开始合成的，这些肽链几乎整条链上都分布有3H-Leu还有更多的肽链一段在3H-Leu加入前另一段在3H-Leu加入后合成，且长短不一。这样，血红蛋白链有如图7-2所示的3H-Leu分布。如果培养的时间很短(如30s)，则只有在3H-Leu加入前已经合成了某一片段的那些链，才有可能完成整个链的合成。故靠近某一端的3H-Leu放射性比另一端强许多(图7-2 H p448)且有一定的梯度分布。实验表明，血红蛋白肽链中靠近氨基末端的放射性比活度最低，靠近羧基末端的则最高，从而证明肽链的合成是由氨基端到羧基端的方向延伸的。,五、14C标记氨酰基tRNA对三联体遗传密码的研究 蛋白质是一类按一定顺序排列起来的氨基酸所组成的多肽结构，它的生物合成过程是mRNA密码信息经核糖体解译的转译过程。放射性标记实验技术在了解这个遗传密码的解读上也有重要作用。实验原理如下：由A，U，G，C四种核糖核苷酸中的三种人工合成某一种三核苷酸，取20种氨酰基-tRNA中的一种用14C或3H标记，使该三核苷酸与19种非标记及1种标记的氨酰基-tRNA以及适当的核糖体组成一个反应系统。三核苷酸代表mRNA上的一个三联体密码，使相应的氨酰基tRNA结合到核糖体上。反应结束后看哪一种标记的氨酰基-tRNA可被结合，定出该三核苷酸密码与哪一种标记的氨酰基-tRNA有对应的结合关系，从而可以确定mRNA上三联体密码子在转译成蛋白质中的意义。,本部分主要内容：第七章 蛋白质(或多肽)的放射性标记及分析方法；第八章 同位素示踪技术在DNA序列测定中的应用；第九章 放射性核酸探针的制备及其应用。,第七章 蛋白质(或多肽)的放射性标记及分析方法,一、蛋白质（或多肽）的放射性标记方法在现代生物和医学的研究和应用中，需要将胰岛素等具有生物活性的蛋白质（或多肽）进行特异性的标记，以研究它们在生物体内或离体状态下的生理生化特性及功能与作用机制等。目前主要的标记类型有：放射性标记 酶标记 荧光标记 化学发光标记。蛋白质（或多肽）的放射性标记，目前主要有：化学标记法 生物合成标记法,1、化学标记法（1）125I标记 125I的半衰期为60天，衰变方式为电子俘获（EC），能量为35 kev。为了叙述方便将方法具体化，我们主要以胰岛素的125I标记为例。胰岛素分子是有A，B两条多肽链组成的，分子中共用4个酪氨酸残基，即A14、A19、B16和B26酪氨酸。在没有-SH存在的氧化条件下，125I可置换酪氨酸残基苯环上羟基邻位的氢原子，使之碘化为单碘或双碘酪氨酸。因胰岛素分子中4个Tyr都可以发生此反应，使A14、A19、B16和B26中被碘化的Tyr不只一个。但研究表明，单碘胰岛素比双碘胰岛素具有更高的免疫活性。生物学家、放免学家、医学家和实验内分泌学家在制备单碘胰岛素上作了各种方法学的探索。由于碘化方法不同，对胰岛素的碘化情况也不尽相同。,氯胺T碘化法（CT法）A、原理 放射性碘可参与到蛋白质酪氨酸残基上，形成单碘或双碘Tyr。Na125I的碘是负离子（I-），只有正碘离子（I）才能取代Tyr苯环上与羟基邻位（3位或5位）的质子。因此，反应需加氧化剂。氯胺T（学名：氯胺赶对甲苯磺酸钠）就是一种催化剂，它可从负碘离子上移去一对电子，使之转变成正离子（I-I）或125I碘化反应几乎在瞬间完成。标记的蛋白质用凝胶过滤等方法提纯。反应式如下：,B、操作方法 取胰岛素液10 l（5 l），0.4 mol/L，pH 7.4磷酸缓冲液50 l，Na125I液7.4107 Bq氯胺T液10 l(100 g)。混匀反应1-3 min。加入偏亚硫酸钠(Na2S2O4)液100 l（250 g）（还原过剩的氯胺T），终止反应。反应混合物一般用Sphadex G25或其他柱层析法脱盐得到的标记物是4种单碘胰岛素和双碘胰岛素的混合物。分离方法各种碘标胰岛素（将在下面介绍）。Freychet和Linde等人以大鼠脂细胞来测定氯胺T法标记的胰岛素的生物活性，发现仅为天然胰岛素的60-70%。,C、优缺点 优点：简单、快速。缺点：由于终止反应时，所用的还原剂偏亚硫酸纳的浓度太高，对蛋白质中的二硫键会产生还原作用；标记时，虽然蛋白质分子暴露于氯胺T下的时间很短，但蛋白质分子还是可被氧化脱羧和脱氨。因此，这种碘化反应难以控制，会出现较多的双Tyr取代蛋白质或双碘蛋白质，以及较多的损伤蛋白质，而使产物的免疫活性及生物活性都达不到受体分析的要求。同时，还原剂可能残留于标记物中，使其保存（有效）期较短，一般只有11.5个月。,酶促碘化法 70年代人们开始用酶标记法，此法可避免氧化剂与蛋白质分子直接接触。基本原理：将氧化型的125I-结合于酶分子上，形成“酶125I”复合物，然后在酶的催化作用下，将125I转移到蛋白质的Tyr残基上。酶标法得到的产物，标记损伤可大大减少，反应条件也较易控制。主要有三种：,A、辣根过氧化物酶碘化法（Horseperoxidase，HPO法）辣根过氧化物酶能与125I形成酶碘化合物，H2O2由葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生，当I/胰岛素的比值为1.0时，标记产物中单碘胰岛素约占99%。其中A19占98%，A14、B16和B26单碘化合物均小于1%。比活度可达4.4106 Bp/ug左右。几乎只产生一种单碘化合物，即A19单碘胰岛素，是HPO法的优点。已知A19-Tyr在胰岛素单体上位于表面一个不变的区域。这个区域被认为是胰岛素受体结合的区域。这可以解释HPO法所得到标记化合物以A19单125I-胰岛素为主的现象。但随着I/胰岛素比值的增加，A14、B16和B26单碘标记率也随之增加；此外，B16和B26残基位于同一表面区域，在HPO法中，B16和B26单碘化合物却很低。此说明，HPO将125I转移到Tyr残基上的过程，除了接触Tyr的难易程度和空间位置外，还包括酶促作用的选择性。详细机理至今不甚明了（涉及到蛋白质构象问题）。,B、乳过氧化物酶碘化法（Lactoperoxidase，LPO法）1971年Ferychet等人首先采用此法，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离标记混合物，得到了A14和A19两种单碘胰岛素。标记方法如下：取Na125I 37107/1030 l、磷酸缓冲液（PBS）（0.250.5 mol/L，）10 l、胰岛素10 g/10 l、H2O2 50 g/10 l、LPO 1 g/5 l混合，反应5 min，加40%蔗糖4050 l混合，上凝胶柱电泳。在中性条件下，乳过氧化物酶可与125I形成“酶-125I”复合物，然后将125I转移到Tyr残基上。此法与HPO法相似，但不同的是，LPO法所得到的单碘胰岛素中，A14含量较高，可占所得单碘胰岛素的3570%；A19标记物比HPO法少。A链单碘胰岛素占全部标记物的9899%，B链单碘标记物仅占12%。LPO法较简便，省时，得到的A14单碘标记物较多，宜作受体分析。,C、LPO-葡萄糖氧化酶碘化法（Lactoperoxidase-Glucose Oxidase：LPO-GO）由于在LPO碘化法中，H2O2是直接加入的，因此对蛋白质（或多肽）的损伤较大。1977年，Tower等人用葡萄糖氧化酶在溶液中催化氧和-D-葡萄糖，使之连续不断的产生少量的H2O2。这比直接加入H2O2易于控制，避免H2O2太多和局部浓度太大对蛋白质或多肽分子中二硫键和色氨酸，胱氨酸等的损伤太大，从而减少标记损伤，使125I化的蛋白质或多肽能保持良好的生物或免疫活性。,联结碘化法 这是近年来常用的蛋白质碘化法。它是通过末端氨基与碘化试剂形成肽键而完成蛋白质的标记。碘化试剂有：碘苯胺、甲基-对-羟基苯亚胺脂、碘化对氨基苯磺酸、二磺荧光素和Bolton-Hunter试剂（学名：3-（4-羟基苯）-丙酸琥珀酰亚胺脂）。其中以Bolton-Hunter试剂用的最为广泛，它是N-羟基丁二酰和碘化对羟基丙酸形成的脂，可在实验室从N-琥珀酰3-（4-羟基苯）-丙酸盐合成。须注意：Bolton-Hunter试剂在水中很容易失活，酶促法显著减弱其活性，而Bolton-Hunter试剂对活性毫无影响。,固相碘化法 IODOGEN是近年来发展起来的一种固相125I化标记试剂。名称1,3,4,6-四氯-32,62-二苯基甘（代）联脲（1,3,4,6-Tetrachloro-32,62-diphenlglycouril）。1978年Fraker和Speck首次介绍用IODOGEN对蛋白质和细胞膜进行125I标记。IODOGEN不溶于水，故可以固相形式参与蛋白质的碘化过程。以后相继报导用IODOGEN碘化标记大肠杆菌核糖体蛋白质、家兔网织细胞核糖体蛋白质、仙台病毒、人生长激素和促甲状腺素、人细胞和组织培养的细胞、大鼠纤维蛋白质和人纤维蛋白质等。下面介绍利用IODOGEN 125I标记方法标记经去污剂Sarkosyl NL-97裂解的甲型流感病毒的基本过程。A、IODOGEN固相的制备 IODOGEN 1 mg溶于1 ml氯仿中，取10 l加入1275 mm玻璃试管中，室温下在通风橱内用氮气气流将溶剂挥发，待彻底干燥后即可用于标记。B、流感病毒的裂解 纯化的甲型流感病毒X-31（H3N2）50 g，悬浮于100 ml STE（PH 8.0）中，加入25 l 10%Sarkosyl NL-97，37温育15 min。,C、碘化反应 用STE（0.15M氯化钠、10 mM Tris、1 mM EDTA、PH 8.0）充分洗涤。已制备好的IODOGEN固相反应器，以除去管壁上附着不牢固的IODOGEN。将已裂解的病毒悬浮液加入管内，随即加入125I-NaI 0.5 mCi（110 mCi/ml），室温下反应30 min，间或轻轻震荡试管，以增加病毒和125I-NaI与固相IODOGEN的接触机会。吸出管内全部液体，则反应自行终止。以葡聚糖凝胶G-50柱层析除去未标记游离碘。标记病毒的放射性可达310 mCi/mg蛋白。D、对IODOGEN碘化法的评价 此法非常简便有效。碘化反应可在037下进行，反应不受去污剂、变性条件或酶抑制剂的影响。样品从反应管取出后反应即终止。样品可直接进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。因此非常适合于蛋白质体标记。IODOGEN固相管一次可制多个，并能在室温下长期保存。在SDS或Sarkosyl NL-97等变性剂存在下，IODOGEN能有效的标记各种蛋白质或多肽，所获得的放射性活度一般高于氯胺T法。,（2）3H和14C标记 甲基化反应和烷基化反应 蛋白质的赖氨酸（或末端）氨基可与甲醛和硼氢化物发生还原甲基化反应：Pro-NH2+2 HCHO+1/2 NaBH4 Pro-N(CH3)2+1/2 Na H2BO3+1/2 H2O因此，用3H或14C-甲醛或3H-硼氢物可标记蛋白质。按每个氨基加上两个甲基计算，用14C-甲醛可得比放射性为5106 dpm/mg的标记蛋白质，相当于最大理论值的20%。用3H-硼氢物标记蛋白质，其比放射性可达3.5108 dpm/mg蛋白质，比氯胺T碘化法高。NaHB4在水溶液中易分解，这种分解在碱性PH值较慢，在室温pH 9时，其T1/2也只有10 min；在pH 8则仅1 min左右。氰基硼氢化钠在水溶液中稳定，用它代替NaHB4，反应可在pH 7条件下进行，这有利于某些不稳定蛋白质的标记。此外，在蛋白质的多种残基，如半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸和赖氨酸的侧链上，很容易引入羟甲基。d-卤酸盐，如碘乙酸钠或溴乙酸钠是常用的烷化试剂。利用3H或14C烷化试剂可标记蛋白质。,3H和1H的交换反应溶剂中的3H可与肽键和一级胺上的1H交换。利用这个反应可将3H标记在蛋白质上。交换法简便，反应条件温和，不损伤蛋白质活性。但因交换法反应是可逆的，标记原子可迅速回到溶液中9比如2小时内可减少到25%）。因此，用这种方法标记的样品应及时进行分析和测定。,（3）金属蛋白（Metalloproteins）中金属原子的标记生物体内有一些含金属原子的蛋白质（酶），它们在生物体内起着非常重要的作用。如固氮酶的两个组分中，Fe蛋白是一种Fe-S蛋白，MoFe蛋白是由两种不同的亚单位组成的四聚体，并含两个络合和还原底物的Fe MoCo与两个可能起传递和贮存电子作用的、由双Fe4S4组成的P-cluster。因此MoFe蛋白是含金属Mo、Fe的酶。自然界中还存在分别以V和Fe取代Mo（第一固氮酶体系）的第二、第三固氮酶体系。这些事实表明可固氮酶在所含金属种类方面具有生物多样性。目前，许多金属原子和生物大分子的结构和功能的关系还不很清楚。同位素示踪技术是进行此项研究的重要手段之一。下面我们主要以99Mo标记Mo Fe蛋白为例，进行这方面的探讨。其化学标记主要有拆卸与组装法。先将蛋白质中的金属部分在某种条件下拆卸下来，使之与多肽链分离，再用带放射性的重组液与这种多肽链在一定条件下重组，将金属部分进行重心组装而后标记。例如，用邻菲啰啉和氧或尿素可将Mo Fe蛋白中的P-cluster和Fe Mo Co部分或全部拆卸下来而得到不全蛋白（apo-protein），再用含99Mo、Fe、S的重组液与apo-protein重新组装金属原子簇，从而使重组的Mo Fe蛋白带上99Mo的标记。,*棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)野生型固氮菌含钼固氮酶的基本结构 固氮酶是一种由两种组分蛋白组成的金属酶。棕色固氮菌含钼固氮酶由铁（Fe）蛋白（Av2）和钼铁（MoFe）蛋白（Av1）。Av2 Av1=subunit;,=,subunit,respectively Fe4S4=4Fe cluster M=FeMoco;P=P-cluster 电子的传递路线为：Av2伴随MgATP水解，通过其4Fe-4S簇将电子传至Av1的P-cluster,然后至底物还原中心FeMoco。,Av2为两个相同亚单位组成的2聚体，含个4Fe-4S簇。Av1则为两种亚单位组成的聚体，分子量位220240KD，含一对FeMoco Mo1Fe7S9.homocitrate和两个P-cluster Fe8S7。,FeMoco(铁钼辅因子),P-cluster(两种氧还状态),金属硫蛋白（Metallothprtein，MT）是一种分子量较小，半胱氨酸含量高，热稳定且与金属离子有较高亲和力的蛋白质。MT在调节动物体内微量元素的代谢以及重金属离子的贮存与解毒等方面具有重要的生理意义。对于金属硫蛋白还可以用放射性银（110mAg）通过置换反应进行标记，从而测定其含量。,2、生物合成标记法化学标记法是标记已合成的蛋白质，而生物合成标记法则是在蛋白质合成过程中引入标记原子。主要有体内和体外两种标记方法。（1）体内标记法（in vivo）给机体一个合适的放射性前体（主要为氨基酸）或标记化合物，通过体内蛋白质生物合成将标记原子引入。前体或标记化合物给予的方式对于动物有口服、腹腔、皮下、肌肉或静脉注射，而对植物和微生物则采用喷施或加到培养液中引入。常用的同位素有3H、14C、35S以及金属原子（如99Mo等）。前体多采用亮氨酸和赖氨酸，因为它们在多数蛋白质中含量较高，并且在代谢过程中不会转变成其他氨基酸。蛋氨酸在蛋白质中含量虽然不高，但由于它们可用35标记，比放射性较3H标记的氨基酸高且比较便宜，故也常用于生物合成标记。标记前体或化合物的引入量和时程，随使用的生物、标记前提或化合物的放射性强度、代谢通路及问题的性质而定。经常可根据经验或通过预实验确定方案。例如对固氮菌中Mo Fe蛋白的99Mo标记，只要在培养液中加入1M（99Mo活性为1 mCi）的Na299 MoO4可得到活性约10Ci的样品。,体内标记法的特点：标记蛋白质的性质不会有任何改变，能同时标记多个器官或多种组织的蛋白质。在研究整体代谢方面，体内标记是不可缺少的。但它的应用有其局限性，这是因为：标记前体或化合物通过道谢通路参加蛋白质，由于代谢库的稀释作用，供细胞合成蛋白质所用的标记前体或化合物的比放射性降低，并且难以测定；代谢库本身有随代谢速率而变，故难以估计；放射性物质用量大，既造成浪费又易造成污染。（2）体外标记法（in vitro）体外标记法主要是借助细胞培养技术，把标记前体或化合物加入到培养液中，细胞通过生物合成而完成标记的方式。一般多用氨基酸或有机离子作为标记物，故他们很容易穿古过细胞膜。与体内标记相比，体外标记的最大优点是可以精确控制温度、pH、离子强度等环境因素。同时，可对不同组织或器官以及不同生长时期的细胞进行标记。,二、标记蛋白(多肽)的分离技术不论采用前述中的任何标记方法，得到的产物均是各种物质的混合物，因此需要进行分离和纯化。根据被分离物质的分子量，电荷等物理性质及状态的不同，可采用吸附与分配层析、离子交换层析、凝胶层析、素和层析、电泳、超速离心、色谱等技术进行分离。下面着重介绍以125I标记胰岛素时，所得各种混合物的分离技术。用125I标记胰岛素时，混合物主要包括：1、未标记胰岛素；2、四种单碘标记胰岛素；3、双碘及双取代胰岛素；4、损伤而未被标记的胰岛素；5、损伤的标记胰岛素；6、游离的无机盐离子，如125I-；7、其他（如氧化剂或酶及其降解产物等）。分离纯化常用的方法主要有：,1、分子筛法 单碘胰岛素分子中的Tyr酚环羟基邻位上的氢原子被一个碘原子置换后，酚羟基的pK值从10.1下降到8.6，被两个碘原子置换，pK值降至6.8。在pH 8.6时，原型胰岛素所带的净电荷为单碘胰岛素的一半，pH为6.8 时，则差别更大。根据在相同pH时，碘化胰岛素所带静电荷不同于原型胰岛素的原理，有人用离子交换层析，或聚丙烯酰胺凝胶电泳法将标记胰岛素和未标记胰岛素分开。2、离子交换法 用DEAE-Sephadex A25，AE纤维素，Amberlite IRA-400阴离子交换树脂，采用梯度洗脱或改变洗脱液离子强度或pH等方法，可将未标记胰岛素、标记胰岛素（包括单碘、双碘胰岛素）、双取代或双碘胰岛素逐一洗脱下来。但是此法并不能分离碘化位置不同的单碘胰岛素。,3、聚丙烯酰胺凝胶电泳法 此法首先于1959年由Omstein和Darris报道。由于其操作简便，仪器简单，分辨率高，而被广泛应用于生物化学及分子生物学研究。1974年被用于碘化胰岛素的分离，此后不断得到改进。此法能将标记胰岛素与未标记胰岛素，损伤碎片及游离125I-等无机盐分开，还可将单碘A14和A19，双碘胰岛素等分开。聚丙烯酰胺是由95%的丙烯酰胺和5%双甲叉丙烯酰胺经过硫酸铵活化聚合而成。电泳过程中，由于电荷效应和分子筛效应的差别，Rf值不同，使标记混合物中各种成分能得到分离，A14和A19单碘胰岛素虽然都标记一个125I-，但亦能被分开；确切机理尚不清楚。B16和B26单碘胰岛素与A19标记物Rf值相同，不能分开。无机盐（包括125I-），在此系统中泳动最快，在指示染料带之前，能满意除去。由此得到的A14和A19单碘胰岛素质架期可达6个月。其他如等电聚焦法亦可获得较纯的A14和A19单碘标记物，但方法较复杂，仪器和试剂要求教高，不尽实用。,4、聚丙烯酰胺凝胶电泳加QAE阴离子交换层析 单独采用以上任意一种方法，多不能达到将B16和B26单碘标记物分离出来的目的。国外近年采用聚丙烯酰胺凝胶电泳加QAE阴离子交换层析的方法，得到四种单碘胰岛素（图78）。5、反向高效液相层析（RP-HPLC）近年来，采用反向高效液相层析（RP-HPLC）制备柱分离胰岛素标记物已有报道，发现有较大优点。如：省时、效率高、成本低、分离完全、能得到高比放射性高生物活性的四种单碘胰岛素（图79、10）。,三、标记蛋白(多肽)的分析方法由于在“一”中，利用各种标记方法所得的标记蛋白质均非单一，而是多种蛋白的混合物。为了探明某种特定蛋白质的结构和功能，一方面要建立分离方法，另一方面要建立有效的分析手段。1、抗原抗体放射性免疫分析 这种分析方法是利用抗原和抗体反应的特异性，在蛋白质混合物中加入特异的抗体，形成抗原-抗体复合物，从而检测和定量蛋白质混合物中的目的抗原。通过与蛋白质放射性标记及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合，这种分析方法可检测出低至100 pg的放射性标记蛋白。,2、凝胶电泳和放射自显影分析标记蛋白质电泳谱的分析，大致可分为放射性计数和放射照相两法。前者指用放射性探测器直接定量测定凝胶中的放射性强度；放射照相乃通过射线或间接通过光子的作用使胶片感光成像，然后用显微密度计定量测量。（1）放射性计数法 分段计数 常用的方法是电泳后将乳胶切成小片，分段计数。此法须注意两个问题：A、不要等厚度随机切片，应先染色，选择性切下斑点，以免造成两个宽度相当、强度相等的峰的计数率很不相同；B、因凝胶切片有一定厚度，样品包埋其中，闪烁体渗入能力有限，因而相当部分的放射性不能回收。使凝胶完全溶解，把样品从凝胶中洗脱出来，或将闪烁体掺和到凝胶中去，可以解决分段计数放射性回收问题。,聚丙烯酰胺凝胶可溶于30%H2O2，每片凝胶（厚0.51cm）加1 ml 30%H2O2，60保温至完全溶解，再加合适的闪烁液计数。如果先加0.2 ml 60%过氯酸，再加0.4ml 30%H2O2，则凝胶更易溶解。琼脂糖凝胶在1N HCl，90下很易溶解。凝胶在含6 M尿素的1%SDS溶液中，37，保温40小时，蛋白质可被洗脱出来。其缺点是洗脱不完全，且不确定，放射性稀释也无法避免。闪烁体可掺和到凝胶中（方法见下文）。掺有闪烁体的凝胶片直接放在计数杯中，无需加闪烁液即可计数。,整胶扫描 薄层层析和纸电泳后，分离图谱上放射性计数管广泛采用钟罩或计数管扫描，但后来为高灵敏液体闪烁计数技术取代。现在，通过改良扫描装置，提高钟罩流气或计数器的灵敏度，放射性扫描的灵敏度已与液体闪烁计数法相当，足以对聚丙烯酰胺胶板进行定量探测。西德 Berthold公司生产的线形分析器，可通过钟罩式计数管的移动（移动速度取决于放射性强度）逐行扫描整块凝胶。它不仅可以象普通流气式计数器那样计数放射性脉冲，还可以定出脉冲发射点在阳极丝上的出现和到达末端的传播时间完成的。每行同时处于线形分析器计数管的开放式入射窗（约251.5 cm）下，记录脉冲的阳极丝与入射窗长轴平行。同时记录位于该行上所有放射性的位置。这种线形分析器20 min可记录只有250 dpm 3H或50dpm 14C的放射性斑点。此扫描仪配有专有计算机，可输入整块凝胶的测量程序（扫描行距等），并能做数据处理，包括对各行的比较。这种扫描装置具有操作简便，灵敏度高，分辨力好的优点。,（2）放射照相法 直接放射自显影 电泳凝胶板与感光胶片（X线胶片）直接接触，凝胶中的放射性标记蛋白质发生的射线使胶片溴化银活化成银离子。直接放射自显影适用于检测发射高能粒子或X射线的同位素，例如14C、35S、32P和125I，而且只有当样品中的放射性强度足以形成有效潜影时，才能采用。高能粒子的放射自显影可以直接在凝胶上进行，若为14C则宜先将凝胶干燥，以减少自吸收。凝胶厚度不要超过0.4 mm，否则底层的粒子不能到达X线胶片。32P曝光数小时即可，14C须几天或几周。短时间曝光可在室温下进行，长时间曝光则应在-70完成，以减少样品扩散。干燥凝胶勿须低温曝光。直接放射自显影的灵敏度较高，曝光24小时能检测到6000 dpm的4C或35S，575 dpm的32P，1600 dpm的125I斑点。,间接放射自显影 32P和 125I发射的高能粒子或X射线，不仅可直接使X线胶片感光，也能穿过胶片。若在胶片后面放置增感屏，这些穿透胶片的射线在荧光屏上可产生光子，光子也能使胶片感光，于是使原来的信号增强，此即所谓间接放射自显影。为到达最佳效果，胶片需预闪并且在-70曝光。胶片预闪指在曝光前使胶片预曝光。预闪可以普通电子闪光灯做光源，曝光距离为70100 cm，曝光时间须小于1 mS。预闪胶片不宜保存，应临用前预闪。将预闪胶片的雾化面（预闪时对着光源的那一面）贴着增感屏，干燥凝胶放在胶片另一侧，使成为凝胶：胶片：增感屏“三合板”。也可用两块增感屏，即增感屏：凝胶：胶片：增感屏“四合板”。外面加玻板后捆扎，或用X线胶片匣夹起来，在-70曝光。由于粒子或射线的轨迹并不总是与凝胶垂直，而且X线胶片位于增感屏与凝胶之间，增感屏的使用可以减低影像分辨能力，不过问题并不严重。从表3可以看出，间接放射自显影的灵敏度比直接放射自显影有明显提高。,荧光照相（参考重组DNA的原理与方法P-67）放射自显影不能用于3H和低水平14C、35S的分析。为解决此问题，1974年Bonner和Laskey创造了荧光照相术。把荧光体引入凝胶，使与标记蛋白质直接接触，粒子通过与临近的荧光体相互作用将能量转变为光能，而使胶片感光成像。基本步骤为：电泳固定掺入荧光体干燥曝光。现今可选用的荧光体有：PPO、水杨酸钠、EX3HANCETM 和EXLIGHTXINGTM（后两种是New England Nuclear产品）四种。其中以二甲基亚砜为溶剂，以PPO为荧光体的配方分辨率最好，其他三种都用使放射性影像变宽的缺点。但掺入PPO需较长时间（约5小时），属致癌剂。二甲基亚砜又迅速由皮肤吸收，操作时须极小心。可用冰醋酸代替二甲基亚砜。掺入水杨酸钠的灵敏度与PPO相当，但分辨力较差。其优点是操作时间较短（1小时），比较安全，且价格便宜。后两种荧光体比较贵，但灵敏度较高且无毒性，尤其是最后一种产品，其制备仅需15-30分钟。象间接放射自显影一样，荧光照相欲取得最佳效果，须用预闪胶片在-70曝光。上述三种放射照相技术，最后是获得一张分布着浓淡不一斑点的胶片。这胶片的定量分析可在扫描显微密度计上完成。,3、时间微分扰动角关联分析（TDPAC）（1）TOPAC基本理论简介 设原子核从初态（initial state）i跃迁到中间态放出一个光子后，又从态跃迁带末态（final state）f放出第二个光子。这两种光子的分布不是各向同性的，其分布几率与角有关（是两个光子传播方向的夹角）。即：=().通常称为角关联函数。()是可以进行实验测量的物理量。用探测器D1、D2分别记录源S放出的两条射线，再进行符合计算，当固定一探测器（如D1）移动另一探测器（如D2）测量探测器不同夹角时的符合计数，即可得()，因此()也称为1、2的符合计数率（coincidence count-rate）。根据角动量守恒，初始核自旋速度、最终核自旋速度及产生光子角动量的速度必须符合“三角形法则”，由此推出：,()1+A22Q22P2(cos)+其中，A22称为“各向异性”(anisotropy)系数，它仅由核能级（unclear level）和衰变特性（decay properties）决定；Q22为固体角关联因子（solid angle correction factor）；P2(cos)是二阶legendre多项式(polynomial)。方程（2）中，象A44 Q44 P4(cos)等高次项由于很小而被省略。在99Mo（T1/2=66 h）衰变成99Tc的过程中，绝对强度较大的-衰变主要有：二级联（740-181Kev（分别为12.4%和6.1%）和三级联（740-40-141 Kev（分别为12.4%、0.77%和89.9%）。在上述的二级联和三级练衰变中，A22Q22分别约为+0.08和-0.10（将A22 Q22用有效值表示，既记为A22eff）。由于中间核（如99Tc）有一定寿命，称中间核态寿命（TN），这就意味着i放出1光子跃迁到后，要延迟时间t才放出2光子，再跃迁到f。根据“符合延迟”测量，TN为t的平均值。这说明()也是时间t的函数，可测得：,(,t)exp(-t/TN)（1+A22eff P2(cos)+）在TN内，当中间核态受到核外电磁场干扰时，其测得的角关联函数就会发生变化，即角关联受到扰动，这种现象称为扰动角关联，并记扰动函数为G22(t)。这时角关联函数的表达式应为：(,t)exp(-t/TN)（1+A22eff G22(t)P2(cos)+）因此，通过测定(，t)推出G22(t)，就可知道核探针（nuclear probe）周围的物理和化学环境是否发生变化。对于二级和三级级联衰变，通常中间态的I=5/2，TN=5.19ns。下面我们将讨论I=5/2，核四级相互作用（unclear guadrupole interaction，NAC）与时间无关（涨落可忽略或由于涨落太慢（10-7s）而使核不能跟随，用统计平均表示，记“static”）和与时间有关（涨落在10-10s到10-7 s之间，即用驰豫“relaxtion”）。在轴对称的电场梯度（EFG）张量的影响下，I=5/2态可劈裂成能量分别为E5/2；E3/2和E1/2的三种次级态（substates）。这时扰动函数表达式为：,G22static(t)=0.2+0.371cost+0.286cost+0.143cost 其中=0.9425Ve，而Ve=eQVEE/h是四级频率（VEE是EFG张力在主坐标系中最大的分量，Q是I=5/2时的核四级矩（nuclear guadrupole moment），G22static(t)可用Fourier变换成很简单的形式。当EFG张量不是轴对称时，频率的比值将不再是1:2:3；而有不对称系数来决定：=|(VXX-VYY)/VEE|，|VXX|VYY|VEE|其中VKK是EFG张量在主坐标轴中的分量。下面我们讨论与时间相关的NQIs。即所谓的驰豫现象（relaxtion phenomena）。分两种情况：当量子化轴线重取向（guantization axis reoeients）慢于T=2/时，G22slowrel(t)=e-t/Tcor G22static(t)这种干扰函数适合于溶液中的大分子，如蛋白质等；当量子化轴线重取向（guantization axis reoeients）远远快于T=2/时，G22slowrel(t)=e-t，=15/4（2）Tcorr其中称为驰豫时间常数，这种干扰函数适合于溶液中的小分子。方程和中的Tcorr是当温度为300 k，粘滞度（Viscodity）为1 cp时的重取向关联时间（reorientational correlation time）。一般情况下，Tcorr取值范围在10-12 s（小分子）和10-8 s（大分子）之间。,（2）TDPAC的应用举例 由（1）中关于TDPAC的基本理论可知，TDPAC是将级联放射性的核素（如99Mo），用化学标记法或生物合成标记法，引入生物大分子中（如MoFe蛋白或Mo贮存蛋白）中，以这一放射性核素为微观探测原子核，通过观察和测定在不同理化条件下，扰动角关联的电四级相互频率Ve、不对称系数及驰豫时间常数等参数的变化，来推测探测原子核（如99Mo）周围的电荷分布和电荷转移等微环境的变化。1992年Schwab等用DAPC方法研究了转铁蛋白等生物大分子的结构。1993年，Morttner等用TDPAC法对99Mo培养的克氏肺炎杆菌固氮细胞及在氨气存在下如99Mo培养的棕色固氮菌细胞进行了研究。分别测定了上述细胞中MoFe蛋白和Mo贮存蛋白中99Mo周围的核四级相互作用信息。利用TDPAC法测定MoFe蛋白和Mo原子周围化学环境在不同外界条件下的变化，从而可为Mo在Fe Moco中的状态和作用提供直接证据。1993-1996年，黄巨富等利用TDPAC技术证明了MoFe蛋白制备成缺失金属原子簇的不全蛋白后，能与“重