蛋白翻译后修饰.ppt
蛋白翻译后修饰,1 定义,翻译后修饰（英语：Post-translational modification，缩写PTM；又称后转译修饰）是指蛋白质在翻译后的化学修饰。对于大部份的蛋白质来说，这是蛋白质生物合成的较后步骤。,2 蛋白质翻译后修饰的类型,蛋白质翻译后修饰是一个复杂的过程，目前在真核生物中20 种以上的修饰类型，比较常见的为甲基化、乙酰化、糖基化、泛素化、磷酸化以及近年发现的SUMO化。,2.1 甲基化,蛋白质的甲基化修饰是在甲基转移酶催化下,在赖氨酸或精氨酸侧链氨基上进行的甲基化。是指从活性甲基化合物(如S 腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。,组蛋白甲基化,是发生在组蛋白合成之后,以硫代腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体,在组蛋白甲基转移酶的(histone methyltransferase,HMTases)的催化下,将基转移到蛋白质的Lys或Arg残基上。组蛋白甲基化,组蛋白赖氨酸甲基化.,组蛋白精氨酸甲基化,组蛋白甲基化,1.组蛋白赖氨酸甲基化组蛋白赖氨酸甲基化发生在H3-K4,H3-K9,H3-K27,H3-K36,H3-K79和H4-K20上,还可发生于H1 N端。H3-K9,H3-K27,H4-K20的甲基化与染色体的钝化过程有关,而H4-K9的甲基化可能与大范围的染色质水平的抑制有关。H3-K4,H3-K36,H3-K79位的甲基化与染色体转录激活过程有关,其中H3-K4的单甲基化修饰可以对抗H4-K9甲基化所导致的基因抑制。,组蛋白的甲基化,2.组蛋白的精氨酸甲基化组蛋白精氨酸甲基化位点为H3-R2,H3-R8,H3R17,H3-R26,H4-R4它们都可以增强转录。,2.2 乙酰化,乙酰化其主要讲把一种乙酰官能基团添加到另一种有机化合物上,并进行结合的过程。乙酰化也是细胞内蛋白质翻译后修饰的一种重要形式。组蛋白等许多蛋白都可以发生乙酰化。,2.2 乙酰化,乙酰化修饰过程主要发生在组蛋白上，是由组蛋白乙酰转移酶(HATs)催化的，其反过程去乙酰化由组蛋白去乙酰酶(histone deacetylases，HDs 或者HDACs)催化的。核心组蛋白的N-末端富含赖氨酸，生理条件下带正电，可与带负电的DNA 或相邻的核小体发生作用，导致核小体构象紧凑及染色质高度折叠。乙酰化使组蛋白与DNA 间的作用减弱，导致染色质构象松散，这种构象有利于转录调节因子的接近，从而可以和转录因子结合，促进基因的转录;去乙酰化则抑制基因转录。,蛋白质乙酰化示意图,2.3 糖基化,蛋白质的糖基化是低聚糖以糖苷的形式与蛋白上特定的氨基酸残基共价结合的过程。糖基化的过程主要是在糖基转移酶的帮助下，使低聚糖以糖苷的方式移动到蛋白质分子上，并与蛋白质分子上特定的氨基酸残基进行共价结合作用而构成糖苷键的经过。,2.3 糖基化,在真核细胞中普遍存在低聚糖通过糖苷键与蛋白质上特定的氨基酸共价结合的形式，主要包括O糖基化、N糖基化、C甘露糖化和GPI(glycophosphatidlyinositol)锚定连接。2.3.1 O糖基化 发生部位：O 糖基化多发生在临近脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基上；构型：糖基化位点处的蛋白多为构型；过程：O 多聚糖以逐步加接单糖的形式形成低聚糖，主要在高尔基体与细胞核或细胞质中形成。,2.3 糖基化,发生在高尔基体上：起始于丝氨酸和苏氨酸羟基上连接N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖及海藻糖等的还原端;发生在细胞核和细胞质中：在丝氨酸或苏氨酸残基上连接一个单糖N-乙酰葡萄糖胺。在哺乳动物体内最常见的O 糖基化形式是由GalNAc 转移酶催化的O-GalNAc 糖基化，进而连接Gal，GalNAc 或者GlcNAc 部分。,2.3 糖基化,2.3.2 N糖基化N糖基化是在内质网上由糖基转移酶催化，在内分泌蛋白和膜结合蛋白的天冬酰氨残基的氨基上结合寡糖的过程。普遍认为N 位糖基化发生在蛋白Asn-Xaa-Ser/Thr(Xaa 为除脯氨酸外的所有氨基酸残基)序列上,少数情况下Asn-Xaa-Cys 序列也作为糖基化位点。2.3.3 C甘露糖化C甘露糖化是将一分子-mannopyranosyl残基通过C-C键连接到色氨酸吲哚环C-2上，这种糖基化方式多发生在模体W-X-X-W，W-XX-C 或者W-X-X-F的第一个色氨酸残基上。,2.3 糖基化,GPI锚定连接GPI锚定连接指的是磷脂酰 纤维糖组在靠近蛋白C 端部位结合，将蛋白连接到细胞膜上。蛋白质发生糖基化反应，从而有糖蛋白这种物质的产生，此过程一般在内质网上发生，并且糖基化拥有很多功效，主要是对调控蛋白质发生修饰和改善蛋白质的生物作用。,2.3 糖基化,细胞中涉及糖基化的蛋白质,2.4 泛素化,泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞内，故名为泛素。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶识别并降解,这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径.与消化道内进行的蛋白质水解不同,从泛素与蛋白的结合到将蛋白水解成小的肽段,整个水解过程需要能量参与。,2.4 泛素化,2.4.1 泛素-蛋白酶系统泛素-蛋白酶系统是存在于所有真核生物细胞的调控系统。降解过程中需要三种酶的参与:泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素蛋白质连接酶(E3)。泛素化降解蛋白的过程中对蛋白的特异性识别依赖E3.由E2s 和E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶(DUBs)逆转.。,2.4 泛素化,目前发现的DUBs 可分为两大类:泛素碳端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)和泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-spicific processing proteases,UBPs)，两者都是半胱氨酸水解酶。泛素化降解蛋白的过程中对蛋白的特异性识别依赖E3.由E2s 和E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶(DUBs)逆转通常情况下,UCHs 主要水解羰基端的酯和泛素的氨基键,也可以分解泛素前体,生成活泼的泛素分子;UBPs 分解泛素多聚体链。,2.4 泛素化,2.4.2 泛素化在生命体中的作用泛素化对于细胞分化、细胞器的生物合成、细胞凋亡、DNA 修复、新蛋白生成、调控细胞增殖、蛋白质输运、免疫应答和应激反应等生理过程都起到很重要的作用。Bence 等发现,蛋白的沉积可直接削弱泛素-蛋白酶系统的功能.两种不相关但有聚合倾向的蛋白的瞬时表达,几乎可以完全抑制泛素-蛋白酶系统.由于泛素介导的蛋白质水解在调节细胞活动中的重要地位,引起蛋白聚集的潜在机制将导致细胞的紊乱和细胞凋亡。,2.4 泛素化,泛素化也是组蛋白修饰的一种重要形式,组蛋白的H2A 和H2B 是泛素化多发位点,已经找到了组蛋白H2B 泛素化酶1315,并且发现组蛋白H2B 泛素化和组蛋白甲基化存在关联。激活子的泛素化对于转录激活是十分重要的。2001 年 Salghetti 等19提出,泛素化可以作为激活作用和激活子重新构造的双信号,调节TAD 功能。E3Met30 使转录激活子VP16 TAD 泛素化。,2.4 泛素化,泛素-蛋白酶系统对蛋白特异性水解机理,2.4 泛素化,DUBs参与的泛素调控,2.5 磷酸化,磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将 ATP的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。在有机体内，磷酸化是蛋白翻译后修饰中最为广泛的共价修饰形式，同时也是原核生物和真核生物中最重要的调控修饰形式。磷酸化对蛋白质功能的正常发挥起着重要调节作用，涉及多个生理、病理过程，如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等。,2.5 磷酸化,磷酸化的过程作用位点：蛋白上的 Ser,Thr,Tyr 残基大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的,至少有30%的蛋白被磷酸化修饰。可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等.Fisher 和 Krebs 因其在蛋白质可逆磷酸化作为一种生物调节机制方面的研究而获得 1992 年诺贝尔生理学及医学奖。,2.5 磷酸化,磷酸化调节细胞的过程,2.5 磷酸化,细胞信号转导过程：一些激素或细胞因子与细胞膜受体或细胞内受体结合并被激酶激活,激素或信号因子随着激酶的磷酸化也被磷酸化,引起细胞内的信号效应。癌症研究中：微管蛋白的磷酸化可能导致癌症的发生.细胞中使用“最后检验点策略”(LCP)控制细胞凋亡,即将含有硝基化酪氨酸的-微管蛋白组装到微管上,这将导致微管功能失常而最终导致细胞凋亡.但如果微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL)被磷酸化,将可能使细胞“躲过”LCP 控制的细胞凋亡,从而最终发展成为癌细胞.,2.5 磷酸化,DNA新陈代谢的研究中：细胞中DNA损伤可导致人的复制蛋白 A(RPA)32 kD 亚基 N 端的过度磷酸化,这有助于调控 DNA 的新陈代谢,促进DNA 修复.有数据显示,过度磷酸化会导致 RPA 构象改变,降低 DNA 复制的活性,但不会影响 DNA 的修复。2.6 SUMO 化SUMO为小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related mod-ifier，SUMO)分子，是一种近年发现的泛素样分子，也参与蛋白质翻译后修饰，但是不介导靶蛋白的蛋白酶体降解，而是可逆性修饰靶蛋白，参与靶蛋白的定位及功能调节过程。,3 研究方法及关键技术,3.1 甲基化研究方法及关键技术甲基化特异性的 PCR：其基本原理是把所有的基因组 DNA 用亚硫酸氢盐进行处理，如此做是因为尚未发生甲基化修饰的胞嘧啶都会被作:用变为尿嘧啶，但进行甲基化修饰的胞嘧啶则不会发生改变。由上面的原理可知，采用不同种类的引物做 PCR，即可检测出这种微弱的变化，这样就能确定基因是否存在甲基化。亚硫酸氢盐测序法：利用重亚硫酸盐对 DNA 进行处理，此过程会使没有进行甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶，但进行甲基化的基团则不会。然后把经作用的物质为基础，加入甲基化特异性的物质(primerI)或者非甲基化的物质(primerII)，使其进行特异性的扩增。高分辨率熔解曲线法,3 研究方法及关键技术,3.2 乙酰化研究方法及关键技术通过生物质谱鉴定乙酰化修饰位点：质谱技术通过检测到的肽段的质量与预测的肽段的质量进行对比，如果二者质量相差 42amu则认为在氨基酸残基或在蛋白质末端发生乙酰化修饰。通过从鉴定到的肽段的N末端或 C 末端逐个分析得到的b离子或 y 离子，就可以确定发生乙酰化修饰的氨基酸位点。,3 研究方法及关键技术,基于特异性识别乙酰化赖氨酸残基的乙酰化抗体：对于赖氨酸的乙酰化修饰，Kim 及其同事用免疫亲和纯化技术富集赖氨酸乙酰化修饰的肽段，在 Hela 细胞的细胞质、细胞核和线粒体中发现了 195 种赖氨酸乙酰化修饰蛋白。但是，赖氨酸乙酰化抗体只能特异性识别赖氨酸残基发生修饰的蛋白质或肽段，不能检测到丝氨酸和苏氨酸的乙酰化修饰。用特异性识别丝氨酸或苏氨酸乙酰化修饰的抗体将大大有利于丝氨酸和苏氨酸乙酰化修饰的蛋白质组学分析。,3 研究方法及关键技术,以标记底物为基础的方法：Yu及其同事在酶GNAT的作用下，用氯代乙酰化CoA与其作用底物L12反应，导致氯代乙酰化L12的生成。然后将氯代乙酰化L12与荧光素His18俘获的肽段一起孵育，经过氯消除后，纯化后的标记的底物通过荧光自显影便可看到。3.3 糖基化的研究方法及关键技术放射性标记法：其过程分为以下几步进行:首先，是对所需的糖进行特殊标记;其次，把处理好的糖加入培育好的细胞或组织中;最后，就利用放射性自显影技术对其进行鉴定。,3 研究方法及关键技术,分子荧光标记法：鉴定糖基化蛋白最为普遍和最具效率的技术当属荧光分子标记法，其基本原理是因为一部分的糖蛋白拥有自发光特点，所以能直接采用所检测的荧光值说明蛋白进行糖基化修饰的程度，荧光值是利用荧光分光计来测量的。电泳法：最古老对糖蛋白进行鉴定的技术便指电泳法，其包含单、双向电泳两种，这两种技术能够鉴定出糖蛋白。日常使用亲和电泳比色法和SDSPAGE法对糖基化程度的高低及糖基化中是否发生血红蛋白的隔离进行鉴定。,3 研究方法及关键技术,凝集素标记法：对糖蛋白进行鉴定，最普遍使用的方法就是这种，因为凝集素具有特异功能，能主动吸附糖蛋白，且操作原理简单易懂，因此得到广泛的认可。抗体标记法：抗体标记法是针对糖蛋白所带糖链的类型制备各种抗体，对糖蛋白进行检测。化学酵素法：半乳糖基转移酶能使糖蛋白自动地携带含酮基的蛋白毒素抗体。,3 研究方法及关键技术,3.3 磷酸化的研究方法及关键技术免疫沉淀法：此技术的作用机制是要制备出一种特殊的抗体，它能对所有含磷酸化残基的蛋白进行免疫沉淀，从而能高效地鉴定磷酸化蛋白。流式细胞仪：实验证明，流式细胞仪不仅可以测试转录活化基因STAT的活跃性和检测信号传导的作用，还能利用它检测荧光强度，来分析酪氨酸磷酸化蛋白的浓度大小。双向凝胶电泳法：现今国际上一般是利用2D凝胶电泳对磷酸化蛋白进行鉴定的，此项技术已经在得到科学家的广泛认可，及得到普遍的应用。,3 研究方法及关键技术,固相金属亲和色谱：研究发现，这种方法最开始是被应用在磷蛋白进行亲和纯化的过程中，固相金属和磷蛋白中的磷酸残基之间具有不错吸引力，从而使得这些离子能够被固定在糖蛋白上，最后利用IMAC柱就可以聚集那些进行磷基化的蛋白质，从而对磷蛋白进行了鉴定。3.4 泛素化与SUMO 化修饰的研究方法一般先利用6xHis 这种物质对泛素蛋白进行标记处理，再利用螯合亲与色谱技术来聚集来检测泛素化蛋白质。,4 蛋白质翻译后修饰的生物学功能,修饰基团的引入可能会改变蛋白质的理化性质、结构稳定和空间构象，从而引起蛋白质的功能改变甚至异常，进而导致疾病的发生。糖基化：免疫保护、病毒的复制、细胞生长、细胞与细胞之间的黏附、炎症的产生、很多蛋白，如转录因子、核小孔蛋白、热休克蛋白、RNA 聚合酶、致癌基因翻译产物、酶等，都发生了不同程度的糖基化修饰。,4 蛋白质翻译后修饰的生物学功能,泛素化：在细胞分化、细胞器的生物合成、细胞凋亡、DNA 修复、新蛋白生成、调控细胞增殖、蛋白质输运、免疫应答和应激反应等生理过程都起到重要的作用。磷酸化：它的异常与癌症有着微妙的关系。在癌症研究中发现，微管蛋白的磷酸化可能导致癌症的发生。SUMO 化：SUMO化修饰通过Dynamin相关蛋白DRP1参与线粒体分裂，参与DNA损伤修复、基因组稳定性调节，参与K2P离子通道的调控，同时SUMO还是生物节律调节的重要分子,5 参考文献,本次所做幻灯片根据3篇参考文献所做：1邱望仁,邹国英,查娟娟,霍立田,蛋白质翻译后修饰研究概述J,景德镇学院学报,2014,6(29):43-45;2郭会灿,蛋白质翻译后修饰研究进展J,生物技术通报,2011(7):18-21;3胡笳,郭燕婷,李艳梅,蛋白质翻译后修饰研究进展J,科学通报,2005,11(50):1061-1072;,谢谢大家！,
