苏大分子生物学第十三章.ppt
第十三章 细 胞 凋 亡 及 基 因 调 控,一、细胞凋亡概念,细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed cell death简称PCD），是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种生理性调节机制，在机体中承担着重要的调控作用。细胞凋亡与细胞坏死的机制不同（如图13-1）细胞凋亡与细胞坏死的区别(表13-1),二、细胞凋亡的特征,1、形态学变化：胞核染色质固缩，集聚核周遍呈月斑块浓缩、断裂；胞膜表面泡状突起出芽；细胞体积缩小，园缩，内馅，分割成大小不等膜包凋亡小体。凋亡小体内有完整的细胞器和核物质（用电镜可以检测凋亡小体）（如图13-2）。,2、细胞凋亡的生化过程：细胞基因组DNA的降解：（内源性核酸内切酶的激 活）切割成18020bp的整数倍核小体片段，电泳可呈梯形条带（DNA ladder）（如图13-3）。内核断裂：经DAPI即4-6-二脒基二苯基吲哚荧光染色，可见颗粒状的荧光碎片（核内）；在流式细胞检测细胞周期时可测出亚G1峰，称“G1”期的AP峰（即凋亡峰）（如图13-4）。,三、细胞凋亡的常见因素,细胞凋亡是一种复杂的生理生化过程，可受多种因素的影响，均受基因调控，同时也受环境中的各种理化因子和药物调节。1、诱导细胞凋亡的诱导因子（表13-2）2、细胞因子去处后的细胞凋亡（表13-3）已报道的诱导凋亡的物质（表13-4）抑制细胞凋亡的物质（表13-5）,四、细胞凋亡的基因调控,蝌蚪变成青蛙尾巴消失；胸腺细胞选择性死亡所导致的细胞凋亡都受某些基因的活化、表达和调控。决定细胞死亡的基因称“细胞死亡基因”，反之，抑制细胞凋亡的基因称存活基因，其也受许多基因的控制（表13-6）抗凋亡基因活化表达肿瘤发生恶化若抑制表达肿瘤生长下降，药效好，预后佳凋亡/促凋亡基因受抑/缺失肿瘤耐药，预后不良；凋亡/促凋亡基因激活肿瘤生长下降,1、Ced基因家族（1）Ced 3,ced-4与细胞凋亡有关。与钙离子结合蛋白和丝氨酸/磷酸化有关。（2）ced 9抑制细胞凋亡。通过Ced 3,ced-4发挥作用。（3）其他Ced 1、6、7、8、10、2、5、参与对凋亡细胞吞噬清除。,2、Bcl-2基因家族；（1）Bcl-2基因：抑制细胞凋亡肿瘤发生（2）Bcl-x基因:Bcl-xl同Bcl-2抑制凋亡；Bcl-xs相反，促进细胞凋亡肿瘤生长下降（3）Bax基因：加速细胞凋亡肿瘤生长下降Bcl-2Bcl-xBax三者形成一个凋亡调控系统。（如图13-5）,3、ICE家族（1）ICE来源于单核细胞可作用于IL-1 前体，使之成熟，过量表达会导致细胞凋亡。Caspase结构域和活化Caspase的N端为半胱氨酸蛋白酶募集域(CARD),并有P环(dATP)的结合点,后接20KD的P20区域,内含QACRG活性中心,最后为10KD的P10长羧基末端。当Caspase在2010KD（P20 P10）之间断开，并形成四聚体后才具有酶的活性，而使细胞凋亡。（如图13-6）,Caspase激活途径,A 死亡途径：当膜表面Fas、TNF-a、TRAIL受体与相应配体结合，使Fas相关死亡结构域（FADD）活化，激活Caspase-8/10，进一步激活Caspase6/7,继而激活Caspase-3引起凋亡，同时受ICE抑制物（CrmA)及凋亡抑制蛋白负调控。,B 线粒体途径：当细胞应激因子促使细胞色素凋亡交互因子（CIFA）进入线粒体，引起细胞色素c分解释放至胞质中，通过P环激活Caspase-9，继而激活Caspase-3引起凋亡，并同时受到bcl-2/bax调控。（如图13-7）,（2）Caspase-3又称Cpp32/Yama/Apopain可作用于多聚ADP核糖多聚酶PARP 使之降解为89KD和24KD，破坏PARP修复DNA功能，引起凋亡。（如图13-8）（3）颗粒酶有A和B两种颗粒酶A是丝氨酸蛋白酶，颗粒酶B可催化IL-1 前体成熟，而导致凋亡。4、其它基因和蛋白：P53、C-myc、Fas/Apo-1（表13-6）,五、细胞凋亡常用的检测技术,（一）光镜的形态学观察：普通光镜：细胞园缩，核浓缩、破碎透射光镜：凋亡小体（二）细胞DNA提取物的核酸电泳：电泳后经过溴乙锭染色，在紫外光下呈梯形条带。,（三）MTT法：细胞凋亡，细胞琥珀酸脱氢酶下降，经过MTT呈兰紫色颗粒下降，经过酸化异丙醇溶解后，于490nm波长下测OD值，计算IC50。抑制率（%）=（1-试验组平均A值/阴性对照组平均A值）100%。,(四)荧光法：断裂DNA可被DAPI着色后形成核断裂颗粒荧光。（如图13-9）(五)流式细胞仪检测法测定DNA细胞经乙醇固定后，采用碘化丙锭荧光染料，通透细胞后用流式细胞仪检测：1、测定DNA总量变化 2、测定细胞周期变化S期消失 3、测定凋亡峰于细胞G1期前出现亚G1峰，即凋亡峰。根据凋亡峰占总DNA的比例测定凋亡百分率。,（六）Bcl-2、Bax胞浆蛋白检测：1、免疫组化法：细胞固定滴片，用穿孔素打孔。加Bcl-2抗体，洗涤后加酶标二抗显色镜检。（如图13-10）2、流式细胞仪检测法Bcl-2/Bax：多聚甲醇固定细胞用TB穿孔液打孔加入Bcl-2/Bax单抗洗涤后加入荧光标记二抗洗涤后FCM检测含量。,（七）Bcl-2/Bax基因表达检测：提取细胞mRNA加逆转录酶加入引物，Taq酶PCR扩增cDNA定量检测cDNA量。（八）其他方法：1、磷脂酰丝氨酸（ps）测定2、断裂DNA位点的原位标记试验（如图13-11）,六、细胞凋亡的医学意义,1、凋亡在发生学中的作用(1)研究在胚胎发育过程中，准时发生细胞凋亡，以利控制组织、器官的分化、形成。(2)淋巴系统的阴性选择。(negative selectior)。指在T淋巴细胞、B淋巴细胞分化成熟时，机体经过严格的选择机制，使那些编排细胞表面受体基因发生错误的细胞，以及有可能导致自身免疫性疾病的细胞(具有自身抗原的细胞)发生凋亡，仅有5%左右的淋巴细胞从中枢免疫器官中被分化成熟。(3)神经元发育过程中也存在阴性选择机制，以清除那些有害的（即发错误连接的）或无用的神经元，因此,有50%的神经元细胞在发育成熟前,以凋亡的方式被清除。,2、凋亡与疾病(1)凋亡减少(抑制)所引起的疾病恶性肿瘤 发生易患自身免疫性疾病 易患病毒感染性疾病(2)凋亡增多引起的疾病AIDS神经元变性 骨髓发育不良综合征 障碍缺血性损伤中毒性肝炎,
