对于微生物发酵法生产紫杉醇的探究.ppt

微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展,紫杉醇,紫杉醇是红豆杉属植物的树皮中提出的一种复杂的次生代谢产物，属于二萜类衍生物。是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。通过临床相关研究，紫杉醇是目前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。由于其具有显著抗癌效果，现已成为临床上治疗肿瘤的重要药物。,关于肿瘤,肿瘤是一类严重威胁人们生命和生活质量的重大和主要疾病。我国国内每年新发生癌症患者160 万人,并有130 万人死于癌症。发达国家美、欧、日等每年新增的癌症患者达400 万人左右,全世界癌症死亡人数每年达630 万人。据世界卫生组织预测，在21世纪，癌症将取代心脑血管病成为人类的“第一杀手”。,抗癌机理,对于迅速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇“冻结”有丝分裂纺锤体，抑制微管解聚，使肿瘤细胞停止在G2期和M期于，从而导致有丝分裂异常或停止，直至死亡。紫杉醇也作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子(TNF)受体，促使释放白细胞介素(IL)-1、TNF-2、IL-6、干扰素(IFN)-1、IFN-2对肿瘤细胞起杀伤或抑制肿瘤细胞迁移作用。紫杉醇还有类似脂多糖(LPS)的作用,可调节机体的免疫功能,此外，紫杉醇在临床上的研究也有治疗非癌症方面的作用，如对抗疟作用、多囊性肾病、卡波海里是肉瘤有良好的治疗及抑制作用。据欧洲医生杂志报道，紫杉醇对多种慢性顽症有较好的治疗作用，比如进行性硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、湿疹等，治疗效果都不错。,生产紫杉醇的方法,红豆杉树皮直接提取法化学半合成法化学全合成法微生物发酵法红豆杉细胞培养法 目前国际市场上的紫杉醇主要从红豆杉树皮提取及半合成,迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。,紫杉醇是濒临灭绝的珍稀树种紫杉醇在树皮中的含量极低,仅为干重的0.101%0.106%,且生长缓慢,植株成熟约需100 年。约36棵100 年左右的红豆杉树皮才能提取出用于治疗一个癌症病人所需求的紫杉醇。即使将世界上现有的红豆杉全部砍伐，所提取的紫杉醇也只能挽救12.5万癌症患者的生命，远远不能满足当今市场的需求量。现状：目前98%纯度的紫杉醇国际市场价格为每干克40至60万美元，我国纯度为70%的紫杉醇售价为160至180万元/千克，比黄金价格还要昂贵。,1993年，美国Montana州大学植物病理系的stierle博士等从短叶红豆杉（T.brevifolia）的韧皮部中分离得到一种能产生紫杉醇的内生真菌安德鲁紫杉菌（Taxomyces andreanae）。Stierle等采用质谱（MS）、免疫化学、色谱（TLC、HPLC）和放射性同位素标记等方法，证明了安德鲁紫杉菌的3周培养物中存在紫杉醇及其类似物。能合成紫杉醇的红豆杉内生真菌的发现，为紫杉醇的生产开拓了一条崭新的道路。,能合成紫杉醇的内生真菌的发现,到目前为止,人们已发现20 多个属的内生真菌可以产紫杉醇,到目前为止,人们已发现20 多个属的内生真菌可以产紫杉醇（表1）,其寄主也不仅限于红豆杉属植物,从非红豆杉属植物中也分离到了可产紫杉醇的内生真菌,充分证明了紫杉醇产生菌及其宿主的生物多样性。但目前发现的能产紫杉醇的内生真菌的产值普遍不高，成为阻碍微生物发酵生产紫杉醇产业化的一个不利因素。,内生真菌的分离,标准的真菌分离纯化的方法：取植物组织，消毒，然后用灭菌的刀片将外层组织削去，将内部组织削成小片，小心置入水琼脂培养基中，待菌丝长成后，挑取不同菌丝末端置于PDA 培养基中，观察生长情况。平板灌注法：用灭菌的刀片去除外皮层和木质部，消毒，将红豆杉样品加入到适量的无菌水中，放入研钵中充分研磨，取匀浆注入融化的的PDA 培养基中，摇匀，倒平板，25培养。分离的关键一步是对植物组织表面进行消毒,以控制表生真菌的生长,使内生真菌得以分离。,内生真菌的培养、保存,一般20 25 培养一个月左右,即可形成内生真菌菌落。内生真菌一般在PDA或MID培养基中不形成孢子，或者是在灭菌的寄主茎叶中也不形成孢子，但却可以在康乃馨的叶片上形成孢子。步骤：取康乃馨叶片经过射线照射灭菌后，置于水琼脂培养基中，将分离得到的内生真菌接种到康乃馨叶片上，23下培养1-2个星期后，在康乃馨叶片上形成暗色的子实体结构，对于真菌的鉴定具有重要的作用。保存：在15%的甘油中-70保存,提高菌种生产力,内生真菌紫杉醇的产量本来就不高，加上脱离植物体后，次生代谢往往停止或延缓，因此，必须用一些方法提高菌种的生产力。,一是将从红豆杉树中分离到的紫杉醇生物合成过程中的限速酶的基因转入到紫杉醇产生菌体内，提高关键酶的表达量，进而提高紫杉醇的合成能力。二是从产紫杉醇的内生真菌细胞中分离出产紫杉醇的关键酶基因并将其导入微生物体内，利用其它真菌甚至细菌、酵母菌构建新的紫杉醇高产工程菌株来生产紫杉醇。三是优化发酵培养条件，通过添加碳源、氮源和前体物、特殊的诱导子、抑制剂等物质借助代谢途径工程的研究来提高真菌紫杉醇的合成量。,发酵液中紫杉醇的分离，提纯和检测,紫杉醇的粗提：液液萃取法、固液萃取法、固相萃取法、超临界流体萃取法、沉淀法 纯化方法：有柱层析法、薄层层析法、高效液相色谱法、高速逆流色谱、胶束动电毛细管色谱法、膜分离法、化学反应法等方法。鉴定紫杉醇的存在：有薄层层析（TLC）的方法、质谱（MS）、高效液相层析（HPLC）、UV免疫分析、生物学实验、单抗免疫分析和放射性前体标记等。其中，单抗免疫分析法简单易行且灵敏度高。,结束语,目前，微生物发酵法生产紫杉醇的技术还很不成熟，很多内生真菌产生紫杉醇的次生代谢途经还不是十分清楚，大部分菌株的培养条件还处在摸索阶段。另外，由于紫杉醇是一种比较复杂的次生代谢产物，因此，把产生紫杉醇的次生代谢途经移接到酵母等工程菌中，尚有一定难度。由于这些限制因素，短期内微生物发酵法生产紫杉醇还不能广泛应用到工业生产中。但是，微生物发酵法生产紫杉醇由于其独特的优势，在将来的生产中必定会有很好的前景。,THANKS,