动物生化第三章酶.ppt

第三章 酶 Chapter 3 Enzyme,讲授内容,第一节 酶的一般概念第二节酶的组成与辅酶第三节 酶的结构与功能的关系第四节 酶的作用机理第五节 酶的活力测定第六节 酶促反应动力学第七节 酶活性调节第八节 酶工程第九节 酶的命名和分类,教学目标,掌握一些概念：活性中心、比活性、Km、酶原、别构酶、同功酶、竞争性抑制，非竞争性抑制、最适pH等 了解米式方程的推导过程影响酶促反应的各种因素了解和掌握一些主要的水溶性维生素的名称、生理作用和它们的辅酶形式。,第一节 酶的一般概念,概述：酶的研究历史,酶的发现和提出：1897年，Buchner兄弟用 不含细胞的酵母汁成功实现了发酵。提出了发酵与活细胞无关，而与细胞液中的酶有关。1913年，Michaelis和Menten提出了酶促动力学原理米氏学说。1926年，Sumner从刀豆种子中分离、纯化得到了脲酶结晶，首次证明酶是具有催化活性的蛋白质。1982年，Cech对四膜虫的研究中发现RNA具有催化作用。,一、酶是生物催化剂,酶(Enzyme和Ribozyme)：是由生物细胞产生的具有催化能力的生物催化剂(biocatalyst)。绝大多数的酶都是蛋白质酶催化的生物化学反应，称为酶促反应Enzymatic reaction在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物substrate,二、酶的作用特点,酶和一般催化剂的共性它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。酶本身在反应前后也不发生变化，用量少而催化效率高。酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。,酶作为生物催化剂的特性,1专一性 Specificity酶的专一性 又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性。蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化淀粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。分类绝对专一性 只能催化一种底物发生一定类型反应脲酶、麦芽糖酶、淀粉酶、碳酸酐酶及延胡索酸水化酶相对专一性 键专一性 只对底物分子中某种化学键有选择性的催化作用基团专一性 对键和键一端的基团有严格的要求立体化学专一性 对立体异构体具有高度专一性,2.高效性（酶具有极高的催化效率）酶的催化作用可使反应速度提高10-101倍。过氧化氢分解 2H2O2 2H2O+O2 用Fe3+催化，效率为610-4 mol/mol.S，而用过氧化氢酶催化，效率为6106 mol/mol.S。-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。,3反应条件温和酶促反应一般在pH 5-8 水溶液中进行，反应温度范围为20-40C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。,酶易失活凡能使蛋白质变性的因素如强酸、强碱高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。所以酶作用一般都要求比较温和的条件如常温、常压和接近中性的酸硷度。,.体内酶活性是受调控的如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。,三、酶的化学本质,酶的化学本质的认识过程自从1926年Summer首次证明脲酶具有蛋白质性质以来，人们一直认为，所有的酶都是蛋白质。1986年抗体酶研制成功，是20世纪80年代酶学领域具有突破性意义的工作。80年代，塞克(TCech)和阿尔特曼(SAltman)发现L19RNA具有多种酶的催化功能（核酶 ribozyme）。1995年，Cuenoud等发现有些DNA分子亦具有催化活性。,核酶(ribozyme)1981年 T.Cech发现四膜虫 rRNA前体能通过自我剪接(self-splicing)切除内含子,表明 RNA也具有催化功能,称之为核酶(ribozyme)。抗体酶(abzyme)是具有某种酶活性的抗体，它通过制备抗体的方法制备。它是专一于抗原分子的、有催化活性的一类具有特殊生物学功能的蛋白质，由抗原分子促进而大量产生，并与抗原分子之间有结合专一性。抗体酶是具有催化作用的抗体。它亦是球蛋白。酶的定义：酶是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质，包括蛋白质和核酸等。,四、单体酶、寡聚酶和多酶复合体,单体酶只有一条多肽链，分子量在13 00035 000之间，如：胰蛋白酶、溶菌酶和胃蛋白酶等。寡聚酶 由几个甚至几十个亚基组成，分子量在35 000几百万，例如：乳酸脱氢酶由4个亚基组成。多酶复合体又称多酶体系，是由几种酶彼此嵌合而形成的复合体，分子量很大，一般在几百万，丙酮酸脱氢酶复合体是由丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸转乙酰基酶与二氢硫辛酸脱氢酶彼此嵌合而成的。它有利于一系列反应的连续进行。,第二节酶的命名和分类,一、酶的命名,根据国际酶学委员会的建议，对每一种酶，不仅要有一个编号，而且 还要有两个名称，其中一个是系统名称；另一个是惯用名称(通俗名称)。习惯命名法通常以酶催化的底物加反应的类型，最后标以酶字即成如乳酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶等。但是水解酶类一般仅用底物名称即可，如蛋白酶为催化蛋白水解的酶。为区别酶的来源，有时尚需加上器官和体液名，如胃蛋白酶、唾液淀粉酶等。系统名称包括两部分底物名称和反应类型。若酶反应中有两种底物起反应，这两种底物均需表明，当中用“：”分开。例如：催化乳酸脱氢反应的酶，它的系统名称应该是：乳酸：NAD+脱氢酶。,二、酶的分类,国际酶学委员会根据酶催化的反应类型，将酶分成六大类：.氧化还原酶类(oxidoreductases).转移酶类(Transferases).水解酶类(Hydrolases).裂合酶(Lyases，裂解酶)类.异构酶类(Isomenses).合成酶(Ligases，连接酶)类,氧化还原酶：催化氧化还原反应,转移酶：催化基团转移反应。,水解酶：催化水解反应。这是特殊的一类转移酶，水作为转移的基团的受体。,裂解酶：催化非水解和非氧化的底物的消除反应，或裂解，生成一个双键。,异构酶：催化异构化反应。,连接酶：催化两个底物的连接反应或称之交联反应。,酶的表示举例,在每一大类酶中又可根据不同的原则，分为几个亚类。每一个亚类再分为几个亚亚类。最后，再把属于每一个亚亚类的各种酶按照顺序排好，分别给每一种酶一个编号。例如：乳酸脱氢酶(EC11127)。,第三节 酶的组成与辅酶,一、酶的组成,单纯酶有些酶，如脲酶、胃蛋白酶、脂肪酶等。其活性仅仅决定于它的蛋白质结构。这类酶属于单纯酶(简单蛋白质)结合酶乳酶脱氢酶、细胞色素氧化酶等，除了需要蛋白质而外，还需要非蛋白质的小分子物质，才有催化活性。这类酶属于结合酶(结合蛋白质)结合酶中的蛋白质称为酶蛋白(apoenzyme)；非蛋白质的小分子物质称为辅助因子(Cofactor)。酶蛋白与辅助因子结合之后所形成的复合物，称为“全酶”(ho1oenzyme)。全酶 酶蛋白 十 辅助因子只有全酶才有催化活性。将酶蛋白和辅因子分开后均无催化作用,二、酶的辅助因子,金属离子如Zn2+、Mn2+、Mg2+、铁离子、铜离子等。作用：作为酶活性部位的组成成分，参加催化底物反应；对酶活性所必需的分子构象起稳定作用；在酶与底物分子之间起桥梁作用。在酶催化底物反应过程中，辅酶或辅基作为电子、氢原子、或者某些功能基团(如：氨基、酰基等)的载体，参与反应。小分子化合物如铁卟啉、NAD+、FAD+、FMN等。把那些与酶蛋白结合比较牢固的，用透析法不易除去的小分子有机化名物，称为辅基(prosthetic group)；把那些与酶蛋白结合比较松弛，用透析法可以除去的小分子有机化合物，称为辅酶。在酶促反应中，酶蛋白决定底物的专一性，辅酶决定底物反应的类型，与酶反应专一性有关。金属离子+小分子化合物,一些兼含有有机辅酶和金属的酶类,三、维生素与辅酶,维生素(Vitamin)是维持细胞正常代谢所必需，但需要量极少，人和动物体不能合成或者合成量太少，而必须由食物供给的一组小分子有机化合物。它们新陈代谢过程起着非常重要的调节作用。机体缺少某种维生素时，可以使新陈代谢过程发生紊乱，产生维生素缺乏病。缺少维生素B1时，人产生脚气病，动物产生多发性神经炎。根据溶解性质的差异将其分为脂溶性维生素维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等水溶性维生素维生素B1、维生索B2、维生素B6、维生素B12、维生素PP、维生素C、生物素、叶酸、泛酸等。,维生素B族，如维生素Bl(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素PP(烟酰胺)、维生素B6、叶酸、泛酸等，几乎全部参与辅酶的组成。甚至于有些维生素，如硫辛酸(是类维生素的物质)、维生素C(抗坏血酸)等，本身就是辅酶。在酶促反应过程中，辅酶作为载体，在供体与受体之间传递H原子或者某种功能团(如：氨基、酰基、磷酸基、一碳基团等)。,水溶性维生素及其辅酶的作用,第四节 酶的结构与功能的关系,一、酶活性部位,定义 酶分子中能直接与底物分子结合，并催化底物化学反应的部位。称为酶的活性部位(active site)或活性中心(active center)。酶的活性中心包括两个功能部位：结合部位（Binding site）酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。此部位决定酶的专一性。催化部位（catalytic site）酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。此部位决定酶所催化反应的性质。,酶活性部位的主要特征是：相对酶整个体积来说，活性部位占据的空间很小活性部位是一个三维空间结构 结合底物的特异性取决于活性部位中精确的原子排列 大多数底物都是通过相对弱的力与酶结合 酶活性部位含有结合底物部位和参与催化将底物转化为产物的氨基酸残基 活性部位通常位于酶蛋白的两个结构域或亚基之间的裂隙（clefts或crevices），或位于蛋白质表面的凹槽。,胰凝乳蛋白酶分子的催化部位，包括His57、Asp102和Serl95，它们分布在该酶的两条肽链上，但其空间位置彼此相邻。酶的必需基团直接参与对底物分子结合和催化的基团以及参与维持酶分子构象的基团,二、酶原激活,定义 使无活性的酶原转变成活性酶的过程，称为酶原激活。这个过程实质上是酶活性部位组建、完善或者暴露的过程。,酶原激活的生理意义举例,由胰腺分泌的几种蛋白酶原，必须在肠道内经过激活之后才能水解蛋白质，这样，就保护了胰腺细胞不受蛋白酶的破坏，否则，将产生剧痛而又危及生命的急性胰腺炎。血液中虽有凝血酶原，却不会在血管中引起大量凝血，妨碍血液循环。这是因为凝血酶原没有激活成凝血酶之故。当创伤出血时，大量凝血酶原被激活成凝血酶，从而促进了血液凝固。堵塞伤口，防止大量流血。,第五节 酶催化机理,一、过渡态和活化能,过渡态任何化学反应的全过程一般都包含一个或多个过渡态（中间产物）要达到过渡态，需反应分子具有一定的能量和正确的攻击方向活化能从反应物（初态）转化为成中间产物（过渡态）所需要的能量,二、酶作用高效性的机制,降低了反应的活化能酶如何能降低反应所必需的活化能？中间产物学说 酶与底物首先结合成一个中间产物，然后中间产物分解成为产物和游离的酶,非酶促反应,酶促反应,自由能能,反应进程,底物,产物,ES,ES*,EP,H2O2的分解无催化剂时活化能为75.24 KJ/mol;铂为催化剂时48.9;H2O2酶为催化剂8.36,铂催化,反应过程中能的变化,三、酶作用专一性的机制,锁与钥学说 Emil Fischer提出锁与钥学说。他认为底物结构必须与酶活性部位的结构非常互补，就像锁与钥匙一样，这样，才能紧密结合，形成酶底物复合物。这个学说可以解释酶的绝对专一性，但是不能解释酶的相对专一性。诱导契合学说 Koshland提出了诱导契合学说。他认为酶分子的活性部位结构原来并不与底物分子的结构互补。但活性部位有一定的柔性，当底物分子与酶分子相遇时可以诱导酶蛋白的构象发生相应的变化，使活性部位上各个结合基团与催化基团达到对底物结构正确的空间排布与定向从而使酶与底物互补结合，产生酶底物复合物，并使底物发生化学反应。,诱导契合理论示意图,锁与钥匙学说示意图,四、酶催化高效率的几种机制,(一)邻近和定向效应 邻近效应A、B双底物分子反应基团互相靠近底物的反应基团与活性部位的催化基团互相靠近大大增加了活性部位内底物的有效浓度，从而使底物反应速度大大地提高定向效应在酶活性部位中，催化基团与底物分子反应基团之间，形成了正确的定向排列，使分子间的反应按正确的方向相互作用形成中间产物降低了底物分子的活化能。增加了底物反应速度,(二)底物形变当酶遇到它的专一性底物时不仅酶构象受底物作用而变化，底物分子常常也受酶作用而变化。，称为应变或形变效应(strain effect)。使底物分子中内敏感键中的敏感键的一端更加敏感，更易于发生反应。(三)共价催化某些酶分子的催化基团可以通过共价键与底物分子结合形成不稳定的共价中间产物中间产物极易变成过渡态，因而大大降低了活化能，使反应速度大为提高这种催化称为共价催化共价催化分为亲核催化和亲电子催化。酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基团：His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等；亲电子基团：H+、Mg2+、Mn2+、Fe3+某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。,(四)酸碱催化酸催化在酶活性中心上，有些催化基团是质子供体(酸催化基团)，可以向底物分子提供质子，称为酸催化(acid catalysis)；碱催化有些催化基团是质子受体(碱催化基团)，可以从底物分子上接受质子，称为碱催化。当酸催化基团和碱催化基团共同发挥催化作用时，可以大大提高底物反应速度。在pH接近中性的生物体中，His咪唑基，一半以酸的形式存在，另一半以碱的形式存在，既可以作为质子供体，又可以作为质子受体，而且，反应速度很快。因此，His咪唑基成为许多酶的酸碱催化基团。,酶活性中心上的催化基团,(五)活性部位疏水空穴的影响已知某些化学反应，在非极性(低介电常数)的介质中，其反应速度比在极性(高介电常数)介质中的反应速度快得多。酶分子的活性中心是位于非极性的空穴中的。因此，可以推测，非极性的空穴有利于提高酶促底物反应速度。,第五节 酶活力测定,一、酶活力测定,酶活力（enzyme activity）也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速度来表示酶反应速度（reaction rate）用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。单位：浓度/单位时间,产物浓度,酶反应速度曲线,时间,斜率=浓度/时间=,引起酶反应速度降低的原因：底物浓度的降低；酶的部分失活；产物对酶的抑制；产物增加引起的逆反应速度的增加等,研究酶反应速度以酶促反应的初速度（initial speed）为准。,酶活力测定方法,分光光度法（spectrophotometry）多利用产物在紫外或可见光部分的光吸收性质，选择适当波长，测定反应过程的进行情况。简便、节约时间和样品，可以检测nmol/L水平的变化。荧光法(fluorometry)主要利用底物或产物的荧光性质。灵敏度高，但易受到干扰。同位素测定法同位素标记底物，反应后经分离，检测产物的脉冲数，即可换算成酶的活力单位。灵敏度最高。电化学方法：pH计、氧电极法,二、酶的活力单位,酶的活力单位1961年，提出用“国际单位”（IU）表示酶活力，1个酶活力单位，是指在特定条件下，1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或转化底物中1微摩尔有关基团的酶量。(25C,最适底物浓度和最适pH）1IU=mol/min1972年，提出新的酶活力国际单位最适条件下，每秒钟能催化1mol底物转化为产物所需的酶量定为1Kat=1mol/s 所以：1Kat=60X106 IU 习惯用法：每小时催化1克底物所需的酶量。,三、酶的比活力,定义每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数，用U/mg蛋白、IU/mg蛋白、Kat/mg蛋白 表示实质表示单位蛋白质的催化能力酶制剂的酶含量及纯度常用比活力的大小表示酶分离提纯过程中，每一关键步骤都需测定酶的总活力和比活力，以监视酶的去向,第六节 酶促反应动力学,化学动力学基础,一、底物浓度对酶促反应速度的影响,在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加,1903年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的实验,1.米氏方程的推导,1913年前后，Michaelis和Menten假定 S+E ES快速建立平衡底物浓度远远大于酶浓度 ES分解产物的逆反应忽略不计推导出米氏方程方程：,在Michaelis和Menten的酶促反应动力学基础上，1925年，Briggs和Haldane提出酶反应分两步进行，即“稳态平衡”理论：第一步：第二步：ES 为中产物浓 S 为底物浓度ES的形成速度为：ES的分解速度：,当整个反应体系达到恒态时，二者速度相等,令,则,整理得,E和ES数值难测，用Et（酶总浓度）代替,Et=E+ESEt 为酶的总浓度 EtES 为游离酶浓度,经整理得,因为酶反应速度与ES成正比，所以 即,代入上式，整理后得,当底物浓度极大时 代入上式，得,当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度成正比，符合一级方程当底物浓度较高时，反应速度与底物无关，符合零级反应,2.米氏方程的意义、求法及应用,将米氏方程整理后，得 当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2 Vmax,Km=S 说明米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。,关于米氏常数Km的几点说明,不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数,只与酶的性质有关，而与其浓度无关。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。一般情况下，1/Km可以近似地表示酶对底物的亲和力大小，1/Km愈大，表明亲和力愈大。,米氏常数的求法,双倒数作图法(Lineweaver-Burk),二、抑制剂对酶反应速度的影响,抑制作用与抑制剂凡使酶的活性降低或丧失，但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用（inhibition）。能够引起抑制作用的化合物则称为抑制剂(inhibitor)。（抑制剂不同于变性剂）抑制作用的类型 可逆抑制作用(reversible inhibition)不可逆抑制作用（irreversible inhibition),可逆性抑制,定义 抑制剂与酶以非共价键结合，在用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑制剂与酶的结合是可逆的 分类竟争性抑制反竞争抑制非竟争性抑制,竞争性抑制 抑制剂化学结构与底物相似，能与底物竟争与酶活性中心结合。抑制酶促反应加大底物浓度，可使抑制作用减弱。,反竟争性抑制反竞争性抑制剂只与ES结合，而不与游离酶结合,这种抑制作用称为反竞争性抑制作用。在反竞争性抑制作用中，某些酶分子转换为非活性形式ESI，Vmax减小了（1/Vmax增大）。反竞争性抑制作用也使Km减小（即1/Km的绝对值增大），这是由于ES和ESI形成的平衡倾向于结合I的复合物的形成。增加底物浓度并不能减少抑制剂对酶的抑制程度。,非竟争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，即底物和抑制剂没有竞争作用。三元的中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低增加底物浓度并不能减少抑制剂对酶的抑制程度。,不可逆抑制作用,定义 抑制剂与酶蛋白中的必需基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活,不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性种类有机磷杀虫剂、有机汞化合物、有机砷化合物、一氧化碳、氰化物等剧毒类物质,三.激活剂对酶反应速度的影响,定义 凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂（activator）种类无机离子：金属离子(K+Na+Mg2+Zn2+Fe2+Ca2+)、阴离子(Cl-Br-)、氢离子中等大小的有机分子：某些还原剂、乙二胺四乙酸（EDTA）某些酶类：酶原激活过程中的酶类 原理酶活性中心的必需基团酶-底络合物形成的桥梁作为某些酶的辅助因子保护-SH酶不被氧化,四.酶浓度对酶反应速度的影响,酶浓度对反应速度的影响,E,五.温度对酶反应速度的影响,温度升高,酶促反应速度加快温度升高,导致酶活性降低甚至丧失因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度(optimum temperature)条件下,反应速度最大。酶对温度的耐受力与其存在状态有关。,六.pH对酶反应速度的影响,在一定的pH 下,酶具有最大的催化活性,称为最适pH(optimum pH)过酸或过碱影响酶蛋白的构象，使酶变性失活影响酶分子中某些基团的解离状态（活性中心的基团或维持构象的一些基团）影响底物分子的解离状态应用缓冲液体系维持最适pH,第七节 酶活性的调节,有机体都能够调节酶的活性，以便能够协调大量的代谢过程，适应所处环境的变化、生长和发育。酶活性的调节有两种方式：酶量的调节和酶活性的调节。酶量的调节取决于酶合成的速度和它降解的速度，直接涉及到该酶基因的表达和调控，在高等生物中，需要几小时或几天的时间，所以属于一种长时调控机制，将在基因表达一章讨论。本节重点讨论酶活性的调节。酶活性调节主要介绍别构效应的调控、可逆共价修饰调控和酶原激活，这些调控迅速，可几秒钟或几分钟内实现，属于短时调控机制。,A B C D P,酶活性调节的必要性,在生物体内，酶的活性必须要受调节，否则会引起代谢紊乱。,酶活性调节的类型,酶的变构调节酶原激活酶的共价调节同工酶,底物水平的调节,酶水平的调节,辅助因子的调节,产物调节,一、变构酶,概念 有些酶除了活性中心外，还有一个或几个部位，当特异性分子非共价结合到这些部位时，可改变酶的构象，进而改变酶的活性，酶的这种调节作用称为变构调节(allosteric regulation)，受变构调节的酶称变构酶(allosteric enzyme)，也称为别构酶，这些特异性分子称为效应物(effector)。变构酶分子组成，一般是多亚基的，分子中凡与底物分子相结合的部位称为催化部位(catalytic site)，凡与效应剂相结合的部位称为调节部位(regulatory site)，这二部位可以在不同的亚基上，或者位于同一亚基。,变构酶的类型,异促变构包含催化中心和调解中心同促变构含有2个或2个以上的活性中心，不含专门的调节中心,变构酶生理意义,变构酶动力学不符合米氏酶的动力学，反应底物浓度曲线呈S形。在变构酶的S形曲线中段，底物浓度稍有降低，酶的活性明显下降，多酶体系催化的代谢通路可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则酶活性迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以快速调节细胞内底物浓度和代谢速度。变构抑制剂常是代谢通路的终产物，变构酶常处于代谢通路的开端，通过反馈抑制，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的底物消耗。,S0 S1 Sn,E0,E1,+,-,正作用：凡反应物能使代谢过程速度加快者称为正作用。负作用：凡反应物能使代谢过程速度变慢者称为负作用。,二、共价调节酶,三、酶原激活,四、同工酶,同工酶(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中 乳酸脱氢酶(LDH)有五种同工酶，M、H亚基的氨基酸组成有差别，可用电泳分离。它们活性部位相同或极其相似。,第八节 酶工程,概念 从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造，酶反应器，以及酶个方面应用的技术科学。分类化学酶工程生物酶工程,名词术语,酶（enzyme）:生物催化剂，除少数RNA外几乎都是蛋白质。酶不改变反应的平衡，只是通过降低活化能加快反应的速度。酶活力单位（U，active unit）：酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。,活化能（activation energy）：将一摩尔反应底物中的所有分子由基态转化为过渡态所需要的能量。活性部位（active site）:酶中含有底物结合部位和参与催化底物转化为产物的氨基酸残基的部分。活性部位通常都位于蛋白质的结构域或亚基之间的裂隙或是蛋白质表面的凹陷部位，通常都是由在三维空间上靠得很近的一些氨基酸残基组成的。酸-碱催化（acid-base catalysis）：质子转移加速反应的催化作用。,共价催化（covalent catalysis）：一个底物或底物的一部分与催化剂形成共价键，然后被转移给第二个底物。许多酶催化的基团转移反应都是通过共价催化方式进行的。靠近效应（proximity effect）：非酶促反应或酶促反应速率的增加是由于活性部位处反应剂有效浓度增大（底物靠近活性部位）的结果，这将导致更频繁地形成过渡态。初速度(initial velocity)：酶促反应最初阶段底物转化为产物的速度，这一阶段产物的浓度非常低，其逆反应可以忽略不计。米氏方程（Michaelis-Menten equation）:表示一个酶促反应的起始速度（v）与底物浓度（S）关系的速度方程，vVmaxS/（Km+S）。,米氏常数（Michaelis constant,）（Km）：对于一个给定反应，导致酶促反应速度的起始速度（v0）达到最大反应速度（Vmax）一半时的底物浓度。双倒数作图（double-reciprocal plot）:也称之Lineweaver-Burk作图。一个酶促反应速度的倒数（1/v）对底物浓度的倒数（1/s）的作图。X和y轴上的截距分别代表米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）的倒数。竞争性抑制作用（competitive inhibition）：通过增加底物浓度可以逆转的一种酶抑制类型。一个竞争性抑制剂通常与正常的底物或配体竞争同一个蛋白质的结合部位。这种抑制使得Km增大，而Vmax不变。,非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibition）：抑制剂不仅与游离酶结合，也可以与酶-底物复合物结合的一种酶促反应抑制作用。这种抑制使得Vmax变小，但Km不变。反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibition）：抑制剂只与酶-底物复合物结合，而不与游离酶结合的一种酶促反应抑制作用。这种抑制作用使得Vmax，Km都变小，但Vmax/Km比值不变。酶原（zymogen）：通过有限蛋白水解能够由无活性变成具有催化活性的酶前体。,调节酶（regulatory enzyme）：位于一个或多个代谢途径内的一个关键部位的酶，它的活性根据代谢的需要被增加或降低。别构酶（allosteric enzyme）：一种其活性受到结合在活性部位以外部位的其它分子调节的酶。别构调节剂（allosteric modulator）:结合在别构酶的调节部位调节该酶催化活性的生物分子，别构调节剂可以是激活剂，也可以是抑制剂。同功酶(isoenzyme或isozyme)：催化同一化学反应而化学组成不同的一组酶。它们彼此在氨基酸序列、底物的亲和性等方面都存在着差异。,小结,酶是生物催化剂，酶的显著特点是催化效率高，具有底物和反应的特异性。除了某些RNA之外，绝大部分酶是蛋白质，或是带有辅助因子的蛋白质。酶可以按照它们催化的反应类型分为六大类：脱氢酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶。比活是每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数，比活测定是酶纯化的监测指标，对同一种酶来说，比活越高，酶的纯度越高。酶也和其它催化剂一样，可以通过降低反应的活化能来提高反应速度，使反应快速达到平衡点，但酶不能改变平衡点。,酶活性部位是一个具有三维结构的疏水裂隙，除了含有疏水性氨基酸残基，还含有少量的极性氨基酸残基，极性氨基酸常常参与酶的催化反应。酶活性部位的可离子化和可反应的氨基酸残基形成酶的催化中心。酶催化的两个主要模式是酸碱催化和共价催化。在酸碱催化中，活性部位的弱酸给出质子，而碱接收质子，质子转移可以促进反应进行。在共价催化中底物或底物中的质子与酶共价结合形成一个反应的中间产物。酶促反应速度的提高的很大程度上依赖于底物与酶的结合。底物靠近和定向于酶的活性部位，使得活性部位的反应物浓度急剧增高，结果大大加速了酶促反应。底物诱导酶结合，一旦酶结合底物后又使底物变形，当底物达到过渡态时，酶对底物的亲和力最大，使反应活化能降低，容易将底物转化为产物。,酶动力学实验涉及到反应条件的系统变化和相应的反应速率的测定。酶动力学测定常常是测定反应的起始速度。酶促反应的第一步是形成非共价的酶-底物复合物。酶促反应相对于酶浓度是一级反应，相对于底物浓度的变化表现出典型的双曲线特征。当酶被底物饱和时达到最大反应速度Vmax。Michaelis-Menten方程描述了这样的动力学行为。米氏常数Km等于最大反应速度一半时的底物浓度，就是说此时有一半的酶分子被底物饱和了。动力学常数可以利用计算机分析动力学实验数据来确定，或是通过双倒数作图法测定。一个酶的催化常数（kcat）或转换数等于每个酶分子（或是每个活性部位）每秒钟转换底物（转换成产物）的最大分子数，在数值上kcat等于Vmax除以总酶浓度。当kcat很小可以忽略时，Km是酶对底物亲和力的量度：Km越小，表明酶对底物的亲和力越大。酶促反应的速度也受到抑制剂的影响。酶抑制剂可分为可逆和不可逆抑制剂。可逆抑制剂与酶非共价结合，可逆抑制包括竞争性抑制（Km增加，而Vmax不变）、反竞争性抑制（Km和Vmax都成比例地减少）、非竞争性抑制（Vmax减少、纯的非竞争性抑制Km不变，而混合型非竞争性抑制中Km增大或减少）。不可逆抑制剂与酶共价结合，酶用不可逆抑制剂处理后，然后测定蛋白质片段的序列，有可能确定活性部位的氨基酸残基，有可能解释酶催化的机制。,酶促反应受pH和温度的影响，大多数酶都存在一个最适pH和最适温度，但最适pH和最适温度都不是酶的特征常数。在最适pH和最适温度下酶促反应具有最大反应速度，大多数酶的反应速度-pH以及反应速度-温度曲线是钟型曲线。别构调节剂通过作用于代谢中关键酶活性部位以外的部位调节代谢过程，这样关键的酶又称之别构酶，一般都是寡聚酶。别构酶表现出的动力学曲线是S型曲线（反应速度对底物浓度），不是双曲线型。别构调节剂通过控制R：T比例改变调节酶Km或Vmax值。酶的活性也可以通过共价修饰调节，常见的共价修饰是酶的磷酸化，磷酸化常发生在活性部位的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链上。,思考题,称取25mg蛋白酶粉配制成25毫升酶溶液，从中取出0.1毫升酶液，以酪蛋白为底物，用Folin-酚比色法测定酶活力，得知每小时产生1500微克酪氨酸。另取2毫升酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2毫克（蛋白质中氮的含量比较固定：16）。若以每分钟产生l微克酪氨酸的酶量为1个活力单位计算。根据以上数据求：（a）1毫升酶液中所含蛋白质量及活力单位。（b）比活力。（c）1克酶制剂的总蛋白含量及总活力。,新掰下的玉米的甜味是由于玉米粒中的糖浓度高。可是掰下的玉米贮存几天后就不那么甜了，因为50糖已经转化为淀粉了。如果将新鲜玉米去掉外皮后浸入沸水几分钟，然后于冷水中冷却，储存在冰箱中可保持其甜味。这是什么道理？,