分子生物学第四讲.ppt

Molecular Biology,PhD.Ming Jiang,分子生物学,分子生物学,转录 Transcription,Semi-conservative mechanism(半保留机制)Replicons(复制子),origins(复制起始点)and termini(复制终点)semi-discontinous replication(半不连续复制)RNA priming(RNA引导),复习上讲,5,5,3,3,5,5,3,3,Leading strand,Lagging strand,Okazaki fragment,半不连续复制,1、对酵母、细菌以及几种生活在真核生物细胞中的病毒来说，都可在DNA独特序列（）处观察到复制泡的形成。,复制起点,2、帮助DNA解旋的（）与单链DNA结合，使碱基仍可参与模板反应。,单链DNA结合蛋白(SSB),3、在DNA复制过程中，连续合成的子链称()，另一条非连续合成的子链称为()。,4、在DNA复制和修复过程中修补DNA螺旋上缺口的酶称为(),DNA连接酶,5、DNA后随链合成的起始要一段短的()，它是由()以核糖核苷酸为底物合成的。,RNA引物,DNA引发酶,Proteins and enzymes of DNA replication,DNA helicase(DNA解旋酶)single-strand binding protein(SSB,单链结合蛋白)DNA primase(DNA 引发酶)DNA topoisomerase(拓扑异构酶，type I&II)DNA polymerase(DNA聚合酶)DNA ligase(DNA 连接酶)Primosome(引发体),DNA复制过程中的一种负责专一性引发的多酶复合物，位于复制叉的前端，能够生成后随链冈崎片段合成必需的RNA引物，主要成分为引物酶（如DnaG）以及DNA解旋酶（如DnaB）等,DNA复制的方式,1、型复制 原核生物 2、滚环复制 噬菌体 3、D环复制 mtDNA（线粒体DNA）,END OF REVIEW,转录 Transcription,转录 Transcription,一、基本概念（RNA的酶促合成、转录信号等）二、RNA合成的过程三、原核生物和真核生物的转录四、研究RNA的方法,这一章将要学习的内容：,1、转录（Transcription)的概念 在RNA聚合酶（RNA Polymerase）的催化下，以DNA为模板合成RNA的过程。The enzymic synthesis of RNA based on a DNA template.,一、基本概念,转录 Transcription,2、参与转录所需的物质,前体核糖核酸（The precursor ribonucleotides）rNTP(ATP,UTP,GTP,CTP)Template(模板):DNAEnzyme(酶):RNA polymerase RNA聚合酶,转录 Transcription,有义链(Sense strand),转录 Transcription,RNA合成方向：5 3,3、转录的特征,与mRNA序列相似的那条DNA链称为有义链，又叫编码链.,模板链并非总是在同一条单链上,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,DNA分子上转录RNA的区段，称为结构基因。,结构基因：,转录 Transcription,启动子(Promoter)：位于DNA分子上专一与RNA聚合酶结合并决定转录起始的一段序列。,转录 Transcription,4、Transcription unit（转录单元）,The specific short conserved DNA sequences 特异的短的保守序列upstream from the transcribed sequence,and thus assigned a negative number(location)位于转录起始位点的上游，用负数表示。required for specific binding of RNA Polymerase and transcription initiation(function)是RNA聚合酶特异性结合和转录起始所必需的。,AprE（碱性蛋白酶基因E）mutant promoter will provided for a 100-fold increase in the production of a protein from Bacillus subtilis.,Structure of a typical transcription unit典型转录单元的结构,转录 Transcription,复制和转录相同点：都以DNA为模板合成方向均为53方向都需要依赖DNA的聚合酶遵循碱基互补配对规律原料为核苷酸产物为多聚核苷酸链,转录 Transcription,5、与DNA复制的比较,复制和转录的区别Differences between replication and transcription,转录 Transcription,Initiation 起始Elongation 延伸Termination 终止,转录 Transcription,二、RNA合成的过程,1、起始（Initiation）(模板识别 Template recognition),Binding of an RNA polymerase to the dsDNA RNA聚合酶与DNA结合,Slide to find the promoter 寻找启动子,Unwind the DNA helix 解开DNA双螺旋,Synthesis of the RNA strand at the start site(initiation site),this position called position+1 在起始位点合成RNA,转录 Transcription,“Crab claw”shape of RNA Pol,Active center cleft,转录 Transcription,Binding(closed complex),Promoter melting(open complex),Initial transcription,Initiation,转录 Transcription,2）DNA双链解开,形成转录泡(transcription bubble),1）RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,3）在RNA聚合酶作用下 发生第一次聚合反应,5-pppGpN OH+ppi,RNApol-DNA-pppGpN-OH,起始复合物:,5-pppG-OH+NTP,转录起始反应,Covalently adds ribonucleotides to the 3-end of the growing RNA chain.The RNA polymerase extend the growing RNA chain in the direction of 5 3The enzyme itself moves in 3 to 5 along the antisense DNA strand.,转录 Transcription,2、延伸（Elongation）,亚基脱落，RNA pol 聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,Ending of RNA synthesis:the dissociation of the RNA polymerase and RNA chain from the template DNA at the terminator site.RNA聚合酶和RNA链与模板DNA在终止位点解离。（Rho）因子有ATPase和解旋酶活性。,3、终止（Termination）,Terminator structure,Requires no primer for polymerization 不需要引物Requires DNA as template.5 3 synthesisRequire Mg2+for RNA synthesis activitylacks 3 5 exonuclease activity,and the error rate of nucleotides incorporation is 10-4 to 10-5.没有3 5 外切酶活性 usually are multi-subunit enzyme.,4、RNA polymerase,以DNA为模板，催化2个游离的NTP形成3，5-磷酸二酯键,大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析,参与转录全过程,核心酶 core enzyme,全酶 holoenzyme,s factor:,有序的因子的替换,RNA聚合酶识别不同基因的启动子。因子是核心酶和启动子之间的桥梁。,许多细菌能产生一系列不同的因子，用以满足在正常和极端生长条件下调控转录的需要。Many bacteria produce alternative sets of factors to meet the regulation requirements of transcription under normal and extreme growth condition,大肠杆菌中的各种因子比较,核心酶（Core Enzyme）具有的四个功能位点,DNA/RNA 杂交位点(),dsDNA 解链位点(),dsDNA 重旋(),启动子识别位点,DNA有义链结合位点(),Ds：双链,转录 Transcription,三、RNA分子的种类（Page 111）Learn by yourself!,四、真核生物的转录,1、三种RNA聚合酶的特性和功能Three RNA polymerases:characterization and function,Eukaryotes:Three polymerases transcribes different class of genes:Pol I:large rRNA genes;Pol II:mRNA genes;Pol III:tRNA,5S rRNA and small nuclear RNA genes(miRNA),Prokaryotes:One polymerase transcribes all genes,Plant microRNA(miRNA)stem-loop secondary structures examples from Arabidopsis(ath-miR156a,ath-miR319a and ath-miR162a),Oryza(osa-miR162a)and Populus(ptc-miR162a).The mature miRNA sequence is shown in bold letters.Although all structures share a stemloop structure,the shape can vary slightly.Close homologs of the Arabidopsis miRNA ath-miR162a have been found in rice(osa-162a)and poplar(ptc-162a).In those cases,the mature miRNA sequence is exactly the same,while the rest of precursor sequence differs.,New Phytologist(2006),RNA polymerase II,located in nucleoplasm 位于核质中 catalyzing the synthesis of the mRNA precursors for all protein-coding genes.用于所有蛋白质编码基因mRNA前体的合成 RNA Pol-transcribed pre-mRNAs are processed through cap addition,poly(A)tail addition and splicing.前体mRNA需经过加帽、加尾及剪接等加工过程。,“基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。,2、真核基因结构,顺式作用元件(cis-acting element)定义：影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。例：启动子、增强子、沉默子等,（1）启动子：在DNA分子中，RNA聚合酶能够识别、结合并导致转录起始的序列。,（2）增强子：能从启动子的上游或下游数千个碱基处激活转录的序列元件,（3）沉默子：某些基因含有负性调节元件沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。,反式作用因子(trans-acting factors),能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors,TF)。,3、真核生物mRNA的转录后加工,5-端加帽,将初级转录产物的5-pppG水解成5-ppG或5-pG。在5-起始部与另一 ppp G反应生成GpppG（三磷酸双鸟苷）。在甲基化酶作用下第一位 G 甲基化生成m7GpppG。第二位核苷酸的2位也可甲基化成 m7GpppGm。,3-端加polyA尾,和转录终止同时进行，先由外切酶切去3端一些过剩的核苷酸再加入polyA。在胞质中出现的mRNA polyA长为100-200 nt。polyA 的有无与长短是维持 mRNA 的模板活性以及增加 mRNA 本身稳定性的因素。加polyA 尾在核内完成，先于剪接。,五、研究RNA的方法（Learn by yourself）,