特殊毒性作用及其试验与评价方法.ppt

特殊毒性及其试验,特殊毒性试验:致突变试验 致畸试验 致癌试验 繁殖试验（生殖试验）行为试验,一、致突变试验,（一）细菌回复突变试验（Ames test）(1)原理 试验菌种 野生型 突变型 鼠伤寒沙门氏菌 his+his-在缺乏his的培养基 能生长 不能生长,主要是检查受试物引起遗传物质结构的改变及其引起的性状变异的试验,his-AA缺乏,Ames试验原理：,野生型His+,突变型 His-,正向突变,回复突变,物理化学等因素处理,受 试 物,His-培养基,接种,能生长,有致突变性,不能生长,无致突变性,+,(2)使用菌株Ames 1975年推荐的沙门氏菌标准菌株为：TA98,TA100,TA1535,TA1537,TA1538;1983年改推荐用:TA97,检测移码;TA98,检测碱基置换;TA100,检测碱基置换及移码;TA102,检测碱基置换及移码。,(3)试验方法 致突变试验分体内体外两种情况：体外试验：检测间接致突变物，需加S9(体外代谢活化系统)，此法称微粒体间介法。体内试验：可检测直接及间接致突变物，不必加S9 此法称宿主间介法。,(4)关于突变类型 分为:基因突变和染色体畸变 1.基因突变(gene mutation)或称 点突变(point mutation):是指不能用光学显微镜直接观察到的遗传物质损伤 基因突变是遗传物质在分子水平上的改变。包括：碱基置换（base substitution）移码（frame shift）大段损伤（Large deletion or insertion）,碱基置换：某一碱基脱落或配对性能改变 DNA复制时碱基错配（mispairing)第二次DNA复制时按正常配对 遗传下去*转换(transition)：A G C T*颠换(transversion):A T G C 无论转换或是颠换都只涉及一对碱基,故称点突变。*后果：三联密码子的改变，可能出现同义密码，错义密码或终止密码，从而使基因表达 改变。,移码 是DNA中增加或减少一对或几对不等于3的倍数 的碱基改变所造成的突变。这种突变可造成整个DNA或一个基因阅读框架的 改变。后果：移码易造成致死性突变；,大段损伤 是指DNA链的大段缺失或插入。可能涉及数以千计的Nt（核苷酸）。*小缺失（small deletion):缺失的Nt 远远小于显微镜的观察能力。*插入（insertion):一段游离Nt整合到另一染色体的某一位置。*转座子（trasposon):在质粒（plasimd)与质粒之间和质粒与染色 体之间可能出现转移位置的小段DNA。这种位置的转动称为转座（transposition)*后果：a.gene突变；b.产生新的gene c.染色体畸变；d.生物进化。,2.染色体畸变 结构畸变*裂隙和断裂(gap and break):仍保持线状连接者为裂隙,无线状连接者为断裂*无着丝粒断片和缺失(acentric fragment and deletion)微核(micronucleus):无着丝粒断片。微小体（minute body):小于染色体宽度的无着丝粒断 片,常成双出现。*环状染色体(ring chromosome)*倒位(inversion):断片倒转180再重接。,*插入和重复（insertion and duplication)*易位（translocation)*染色体交换（chromatid exchange):指两条或多条染色单体断裂后变位重接。分为：内换（intrachange):同一染色体内的染色单体交换 互换（interchange):不同染色体间的染色单体交换*姐妹染色单体交换（sister chromatid exchange,SCE):用5-Brdurd掺入DNA合成代替了T，产生染色单体差示染 色，可见到两条姐妹染色单体染色一深一浅，如某一染色体 在姐妹染色单体间发生了同源节段内换，同源节段染色一深 一浅，这种现象称SCE。用以分析染色体畸变。(图示),各有一互补链不带Brdude的原链第二周期插入Brdu产生同等干扰带Brdu的新链合成出现差示染色,断裂、重排同位节段互换,染色体数目异常 整倍性畸变：单、三、四、多倍体 数目畸变 非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条 或多多条或少多条 2n-1,2n-2,2n+1,2n+2,染色体数目畸变的原因：a.不分离；b.染色体丢失；c.染色体桥；d.核内复制。,(二)精子畸形试验*常用小白鼠染毒,观察其精子畸形。*精子畸形表现：无钩，香蕉形，无定形，胖头，双头,双尾，尾折叠等。*常与亚慢性毒性试验结合进行。,（三）染色体畸变分析*常用骨髓细胞观察。*观察的内容有：染色体数目畸变：正常:小鼠2n=40,大鼠2n=42 犬2n=78,猫2n=38,豚鼠2n=64 兔2n=44,鸡2n=78,灵长类2n=42 人2n=46。染色体结构畸变：裂隙,断裂,微小体,环状,粉碎,多射体*剂量设计及分组:最高剂量组:LD50的1/8-1/10;中间剂量组:最高剂量组的1/15;最低剂量组:最高剂量组的1/20。,（四）微核试验*微核：细胞核之外，与核染色性一致的颗粒，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，形似 杏仁状或圆形。*来源：染色体断裂而形成的无着丝粒断片。*意义：说明染色体的完整性发生了改变，或染 色体分离改变,表明受试物对遗传物质 产生了损伤。（五）分子生物学方法（PCR检测）,突变的不良后果,二、致畸试验,（一）概念 主要是检查受试物对动物子代的致畸作用。致畸作用包括：1.母体效应:受试物对母体产生了损害作用,从而影响了正常妊娠,而不是对胚胎的直接损害。2.胚胎效应:受试物对胚胎的直接损害作用。3.出生前胎儿效应:出生胎儿出现外表或内脏畸形。4.出生后效应:引起子代的生理功能或生理结构的缺陷。如,后天生长发育或生殖功能受影响。,（二）剂量设计及分组 高剂量组：LD50的1/5或1/3。原则是引起母体轻度中毒，死亡率10%;低剂量组：LD50的1/301/100。原则是不引起母体的任何中毒症状。中剂量组：在高、低剂量之间成等比关系。原则是只引起母体极轻微毒性反应。或者以实际接触量为低剂量，以其10倍量为高剂量。（三）观察内容 产前剖腹产，检查活胎，死胎，吸收胎，黄体数及 外形和内脏畸形情况。,胎仔检查 自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。,（四）致畸结果分析 母体LD50 致畸指数=最小致畸量 评价：致畸指数100,为强致畸物。致畸危险指数=最大不致畸剂量/最大可能摄入量 评价：致畸危险指数300,说明致畸危险性小；致畸危险指数100300，为中等致畸危险性；致畸危险指数100,为致畸危险性较大。,三、致癌试验(经典方法),（一）概念 长期小剂量接触受试物观察其对实验动物的致癌作用 实验动物：大鼠，小鼠，犬及猴。（二）剂量 分两种情况：1.只了解受试物有无致癌作用的可能性：设两组：最大耐受量；最大耐受量的1/31/4 2.除了解受试物有无致癌作用的可能性外,还要确定 其最小致癌作用剂量:,一般要设五组:高剂量组:稍高于亚慢毒性阈剂量,使产生轻微中毒;中、低剂量组:低于高剂量按等比设12组；阳性对照组：用致癌阳性物染毒；阴性对照组：不染毒，观察自然癌发生率。（三）观察内容 肿瘤发生率，潜伏期，一般健康状况，自然寿命；组织器官检查：肉眼、病理组织学检查（光镜及电镜）统计分析：与对照组比较，分析显著性差异；流行病学调查：,（二）致癌作用的其它试验(1)恶性转化试验 1.原代细胞:叙利亚仓鼠胚胎细胞(SHE Cell)人成纤维细胞 小鼠或大鼠支气管上皮细胞 2.细胞系:常用BALB/C-3T3,C3H10T1/2 和BHK-21 3.病毒感染细胞:常用RLV/RE Cell 和 SA7/SHE Cell,(2)哺乳动物长期致癌试验 为经典方法,前已述及。（3）哺乳动物短期致癌试验 小鼠肺肿瘤诱发试验：一次给予受试物,12W后多次给予BHT,试验16-30W 大鼠肝转变灶诱发试验:早期转变灶用组织学观察,进一步发展可用肉眼观察肿瘤结节 小鼠皮肤肿瘤诱发试验：皮肤涂抹,可诱发乳头状瘤或皮肤癌；皮下注射可诱发肉瘤.一般9个月可结束试验,本法多适用于PAH类物质 雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验:一般试验期9个月。,说明：（3）中、两试验常作为新化学物致癌性筛选。上述任一试验结果阳性,其意义与长期致癌试验相当 对于阴性结果,不能作出阴性结论,有疑问者,仍需长 期试验。,（三）关于致癌性预测 1.概述 传统的试验一般为长期试验,费时、费力、费钱 能不能用短期试验进行预测呢？鉴于化学物质致突变性与致癌性的高度关联性，近年来多用致突变检测对致癌物进行初筛。据此，Rosenkranz等提出了一个方法，简写为 CPBS法，即：Carcinogenicity predication and battery selection method（致癌性预测 与试验组合选择）。,2.CPBS法原理 提出一种试验组合的选择,通过聚类分析,选择试验方案。获得各单向试验结果(最好选择敏感性和特 异性高的方法）。根据Bayes原理预测受试物的潜在致癌概率 试验项目数：一般项目数越多，预测就越 准，但费用会增大。一般使用奇数项目数，如3项或5项就比4项或6项要好。,3.预测方法 CPBS是利用Bayes公式,对一组试验结果进行连续运算,得到受试物致癌性概率。如试验结果为阳性，用公式（1）：a+i+i-1 i+=(1)(1-a-i)+(a+i+a-i-1)+i-1 如试验结果为阴性，用公式（2）、（3）：(1-a+i)+i-1 i-=(2)a-i-(a+i+a-i-1)+i-1 i-=1-i+(3),式中：i:为短期试验序号 i+：所预测化学物可能为潜在致癌物的概率 i-：所预测化学物可能为非潜在致癌物的概率+i-1：根据先前试验，对化学物潜在致癌性的 估计概率。如无法估计，则取值为0.5,表示致癌与非致癌概率均等。a+i：某短期试验的敏感性。a-i：某短期试验的特异性，如缺乏此参数，取 值可为0.5代之。,判断标准：+0.7 潜在致癌物 0.3+0.7 暂时无法下结论+0.3 非致癌物 关于a+i和a-i的参数见表,试验方法原则受试动物：性成熟大鼠、小鼠或家兔 剂量分组:一般设立三个剂量组（至少两个剂量组）和一个对照组染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径动物数:每组雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只,生殖毒性试验,试验方案:三代两窝,fb,fa,fb,fb,fa,fa,f,（断奶或出生周）,给予受试物到周,第一次交配,第二次交配,观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况,断乳后给予受试物到周,观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况,断乳后给予受试物到周,两代一窝(和一代一窝)生殖试验,观察指标：受孕率（）:反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况 正常分娩率（）:反映雌性动物妊娠过程是否受到影响 幼仔出生存活率（）:反映雌性动物分娩过程是否正常 幼仔哺育成活率（）:反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力 除上述个指标外，还应该注意出生幼仔是否有畸形存在，对死亡的幼仔应进行畸形检查，可为下一步致畸试验提供参考,生殖毒性的评价,外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行。生殖毒性试验可以全面反映外源化学物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响。,评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用的试验。,生殖毒性的评价,思考题1.急性毒性试验常用哪些试验方法。2.改良karber法的试验要求。3.亚慢性毒性试验的主要目的是什么？4.蓄积性毒性试验的概念。5.Ames试验的原理。6.微核是什么？其来源于何？细胞质中发现微核说明了什么？7.试阐述致畸的母体效应和胚胎效应的区别。生殖毒性的评定指标是什么？,