检验技术离心机.ppt

1,第三章 离心技术及仪器,centrifugal technique and centrifuge,2,经典的分离分析技术：,离心技术、电泳技术、光谱技术、色谱技术,3,离心现象是指物体在离心力场中表现的沉降运动现象。应用离心沉降进行物质的分析和分离的技术称为离心技术（centrifugal technique）,实现离心技术的仪器是离心机（centrifuge）。,前 言,概念:,4,离心技术的应用:,主要用于各种生物样品的分离、纯化和制备,低速离心机主要用于细胞、细胞核、细胞膜、细菌的沉淀和收集；高速离心机多用于制备和收集微生物、细胞碎片、大的细胞器、硫酸铵沉淀物以及免疫沉淀物等；超速离心机已成为分离、提纯、鉴定、分析线粒体、微粒体、染色体、溶酶体、质粒、病毒、大分子核酸和高分子蛋白质,5,6,第一节 离心技术原理第二节 离心机结构第三节 离心方法第四节 高、超速离心技术,主 要 内 容,7,教 学 基 本 要 求,1.掌握离心技术的基础原理，常用的离心方法.2.熟悉离心机的分类与结构，各种离心机的临床应用3.了解离心机的维护、离心方法的进展,8,一、离心力,二、相对离心力,三、沉降系数,四、沉降速度,第一节 离心技术原理,9,当悬浮液静置不动时，由于重力场的作用可使得其中悬浮的颗粒逐渐下沉，下沉的速度与微粒的大小、形态、密度、重力场的强度及液体的黏度有关。如红细胞颗粒，直径为数微米，可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。,重力沉降：,10,扩散现象,扩散是由于微粒的热运动而产生的质量迁移现象,主要是由于密度差引起的。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的，因为颗粒越小，与溶液密度越相近，扩散现象则越严重，而沉降越慢。,扩散现象是不利于样品分离的，如果加大重力，就可能克服扩散现象的不利影响,实现生物大分子的分离。,11,离心沉降：,在离心机中，离心管（centrifuge tube）放于离心转头里，当离心机开动时，离心管绕离心转头的轴旋转，作圆周运动，在离心管内的样品颗粒将同样运动。,12,假如颗粒处于真空中，颗粒会沿切线方向飞去,也就是当离心管由图中的0位转到1位时，颗粒到达离心管底部A位。对于离心管而言，样品颗粒由顶位移到了A位，也就是由离心管顶部移到了底部，这与重力场中的由高处落到低处相似。这种颗粒在圆周运动时的切线运动称为离心沉降.,实际上颗粒是在介质中运动的，颗粒作切线运动时将由于介质的摩擦阻力，使其在离心管中依图中虚线所示的曲线运动，当离心管由0位转到2位时，颗粒由顶位移到B位。介质的阻力越大，颗粒的沉降速度越小、沉降的距离也越短。旋转速度越大，颗粒的沉降越快。,13,在离心力场中加速度达到数万甚至数十万倍重力加速度时，颗粒的沉降也加快了同样的倍数。这就使得许多在重力场中不能沉降的细小颗粒及密度较低的物体组份能用离心技术进行分离纯化。,14,离心机工作原理:,悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而使溶液得以分离、浓缩和提纯，颗粒的沉降速度取决于离心机的转速、物质的沉降系数、颗粒的质量、大小和密度。,15,一、离心力,当物体所受外力小于运动所需要的向心力时，物体将向远离圆心的方向运动。物体远离圆心运动的现象称为离心现象。也叫离心运动。离心运动是由于向心力消失或不足而造成的。,旋 转离心力,离心运动：,16,离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度2 r与颗粒质量m的乘积，即：式中是旋转角速度，(rpm)是每分钟转头旋转次数，r 为离心半径(cm)，m是质量。,离心作用、离心力：,17,二、相对离心力(relative centrifugal force，RCF),相对离心力是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”。,由于各种离心机转子的半径或离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力也不同,因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力,例如25000g,表示相对离心力为25000。只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。一般情况下,低速离心时相对离心力常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g”表示。,=1.11810-5(rpm)2r,g为地球重力加速度(980 cmsec-2),18,通常称离心管顶部到旋转中心的距离为最小离心半径rmin，该处承受的离心力场为最小离心力场；称离心管底部到旋转中心的距离为最大离心半径rmax，该处承受的离心力场称为最大离心力场。,在计算时规定旋转半径均用平均半径“Rav”代替：,19,三、沉降系数,微粒(分子)的沉淀性质以沉降系数(sedimentation coefficient，S)表示，其量纲为秒(s)。1924年Svedberg对沉降系数下的定义为：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。,积分得:(X1为离心前粒子离旋转轴的距离；X2为离心后粒子离旋转轴的距离),若用2n60表示，则:,定义10-13s为一个vedberg单位，即 10-13s。,20,四、沉降速度(sedimentation velocity),沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离,式中r为球形粒子半径；d为球形粒子直径；为流体介质的黏度；p为粒子的密度；m为介质的密度.,将2-7代入2-4可得,当p m，则SO，粒子顺着离心方向沉降；当p=m，则S=o，粒子到达某一位置后达到平衡；当p m，则S0，粒子逆着离心方向上浮。,21,Fc=FB+Ff+FK Fc：离心力FB：由离心力场所引起的浮力Ff：摩擦阻力 FK:扩散作用力 Fc=FB=Ff=f(dx/dt)（f为摩擦系数，单位是g/s),Fb,Fg,FB,Ff,沉降速度的推导方法:,代入上式得：dx/dt=,纵向力,横 向 力,Fc,-,f,FK,22,第二节 离心机构造,一、各式离心机的主要结构装置,二、驱动部分,三、制冷和温度控制,四、离心机的主要类型,23,离心机 的主要构件组成:,驱动电机制冷系统(高速离心机)真空系统(超离离心机)显示系统自动保护系统控制系统,必要配件:,离心转头和离心管,24,25,一、各式离心机的主要结构装置,26,二、驱动部分,(一)转头室,转头室的设计要求:安全、密闭、隔热,应具有一定的强度，外有防护钢板，保证内部破裂飞溅物不能击穿飞出。达到高速旋转时，自动锁定，不能人为地开启。有隔热保护屋。有蒸发盘管组成的内室壁，壁的材质为不锈钢的，便于清洁消毒和耐蚀。有真空装置的转头室，对室盖、电机轴与转室交换处设有密封装置，保证转头室具有良好的密封性。,27,1转头的型式,(1)角式转头(2)荡平式转头(3)垂直转头(4)区带转头(5)连续流动转头,连续流动转头,扇形小室,叶片,径向导管,区带转头,垂直转头,敞开式转头,角式转头,28,2离心管,设计要求:高强度、耐热、透明性,(1)塑料离心管聚乙烯(polyethylene，PE)聚碳酸酯(po1ycabonate，PC)聚丙烯(poly-propylene，PP)特点:透明(或半透明)，硬度小，能耐高温消毒，可用穿刺法取出梯度,易变形，抗强酸强碱及某些有机溶剂腐蚀性差，使用寿命.(2)不锈钢管特点:强度大，不变形，能抗热、抗冻、抗化学腐蚀。但价格高(3)玻璃试管特点:耐热和透明性好，强度差,3管帽,29,(二)驱动电机,多为串激式,包括定子和转子两部分,30,(三)转速调节系统,1交流变频调速将逐步取代直流调速,2多功能、自动化和微机控制,31,三、制冷和温度控制,制冷系统,高超速离心机和一部分低速大容量制备用离心机配置,2温度控制,转头室内的温度由测温元件完成,如蒸汽压力式温度表、半导体热敏电阻和红外线遥感元件。测温元件感测到的信号，通过放大器放大来控制制冷系统,32,四、离心机的主要类型,根据用途：分析型、制备型、分析制备型,根据操作方式：间歇、连续和半连续,根据分离形式：沉降式和过滤式,根据离心机转速：分常速(低速)、高速和超速,根据结构特点：管式、吊篮式、转鼓式和碟式,根据是否冷冻：高速冷冻离心机、大容量冷冻离心机,33,制备性离心机:用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大 分析性离心机:一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质,34,1.制备性离心机:,根据转速常速（低速）高速 超速rpm5000 1000025000 25000 6000g 89000g 89000g适用分离对象细胞微生物菌体、大细胞器 亚细胞器、病毒和 和细胞碎片等 生物大分子等,35,2.分析性离心机:都是超速离心机,使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程，从而确定其物理性质,在分析离心杯中物质沉降情况时，在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产生了一个“峰”，由于沉降不断进行，界面向前推进，因此峰也移动，从峰移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。,36,第三节离心方法,一、分离离心法,二、分析离心法,三、普通低速离心机使用的注意事项,37,离心方法分类：,差速离心法密度梯度离心方法,速率区带离心法等密度区带离心法,分离离心方法,分析离心方法：监测沉降过程，研究生物大分子的沉降 特性和结构,38,一、分离离心法,又称制备离心法，包括差速离心法和密度梯度离心法,39,1差速离心法,是以不同离心力来分离不同质（沉降系数）的微粒的一种动力学方法，因不同的粒子在同一离心条件的离心力场中沉降速度不同，若不断增加相对离心力，一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子将分步沉淀。,原理：,速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀,40,用差速离心法分离已破碎的细胞各组份,特点及应用：,特点：分辨率不高；离心次数多，操作繁杂；产品的纯度和回收率都达不到理论值。应用：用于组织匀浆液中细胞器和病毒的分离及其他分离手段之前的粗制品提取。如破碎细胞各组分(细胞核、细胞膜碎片、线粒体、溶酶体、核糖体)的沉淀分离。,41,2密度梯度离心法,原理：,将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。,分类：依据离心分离原理。,（连续密度梯度离心法）,（不连续密度梯度离心法）,42,(1)速率区带离心法,原理：,在离心前于离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖)，把待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，与梯度液一起离心。靠近旋转轴处的介质密度最小，离旋转轴最远处的介质密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度。这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。,43,梯度液（聚蔗糖(ficoll)、硅溶胶(pereoll)及蔗糖(sucrose)）在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。,44,特点及应用：,特点：分辨力高，但离心时间要严格控制。应用：速率区带离心法是一种动力学方法，适用于测定生物大分子颗粒的沉降系数。速率区带离心是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般应用于物质大小相异而密度相同的情况。,45,(2)等密度区带离心法,原理：,根据样品组分的密度差别进行分离纯化，一般是将待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，密度梯度液柱的密度范围很大，液柱底部的密度明显大于样品组分的密度。如果样品中有几个密度不相同的组分，它们将分别集中于密度梯度液柱中相应的密度位置上，形成几个分离的区带，收集各个区带即得到各个提纯的组分。,46,分辨力高，耗时。是一种测定生物大分子或颗粒的浮力密度的静力学方法。此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时，如分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，简单蛋白质不适用。,梯度介质通常为氯化铯(CsCl),特点及应用：,47,二、分析离心法,目的:,为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组分。,方法:,使用特殊的转子和检测手段，连续监视物质在一个离心场中的沉降过程,沉降速度法,沉降平衡法,等密度区带分析离心法,48,特点:,在短时间内，用少量样品就可以得到一些重要信息,确定生物大分子是否存在、其大致的含量计算生物大分子的沉降系数结合界面扩散，估计分子的大小，检测分子的不均一性及混合物中各组分的比例测定生物大分子的相对分子质量检测生物大分子的构象变化,49,三、普通低速离心机使用的注意事项,稳定平衡限速清洁,50,第四节高、超速离心技术,一、高、超速离心机的组成及特点,二、高、超速离心机的机型介绍和应用,三、超速离心在医学中的应用,四、高、超速离心机操作的注意事项,51,一、高、超速离心机的组成及特点,1高、超速离心机的驱动装置,2高、超速离心机的温度控制,3超速离心机的真空系统,4高、超速离心机的转头,5高、超速离心机离心管的选用,速度控制系统 过速保护系统 装甲钢板密闭,红外线射量感受器,解决温度和摩擦力的影响,角转头和水平转头,选用塑料试管,52,二、高、超速离心机的机型介绍和应用,三、超速离心在医学中的应用,某些品牌型号的离心机的独特性能和特点,(一)分离超速离心技术的应用,(二)分析性超速离心技术的应用,提取和纯化病毒颗粒，分离和纯化RNA、DNA、质粒和蛋白质等生物大分子,测定生物大分子的相对分子质量纯度构象变化,53,四、高、超速离心机操作的注意事项,1离心管平衡允许的误差要小于0.1g。,2超速离心时，液体一定要加满离心管。,3使用角度头时别忘盖转头盖。,