核酸的制备与提取.ppt

核酸的分离与鉴定,王宏伟南京大学医学院,Email:,第一部份、核酸的基本知识；第二部份、常用核酸制备方法；,学习内容,第一部份、核酸的基本知识,第一节 核酸的研究历史；第二节 核酸的化学组成；第三节 核酸的结构特点；,1868年瑞士科学家米歇尔(F.Miescher)发現细胞核內含高量磷的酸性物质，命名为核素(后改名为核酸)早期的研究仅将核酸看成是细胞中的一般化学成分，没有人注意到它在生物体内有什么功能；,第一节、核酸的发现,F.Miescher,核酸作为遗传物质的发現过程,20世纪初，德国生理学家柯塞尔(Kossel)证实了核酸是由四种不同的碱基所组成；美国科学家列文(Levene)又确定了核酸有两种,即DNA和RNA；1928英国科学家格里菲斯(Griffith)利用细菌的性狀转变实验，证明了遗传信息的可传递性；1944美国科学家艾佛瑞(Avery)证实了DNA造成细菌性狀转变的物质基础；1952美国科学家赫雪(Heishey)和蔡斯(Chase)证明遗传物质是DNA非蛋白质；1953年，英国科学家沃森和克里克发现了DNA的双螺旋结构；,一 核酸的概念和重要性(一)概念由核苷酸或脱氧核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子，具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。(二)重要性1.与生命活动关系密切，是重要的生命物质。生命的起源、生长、发育、衰老、死亡与之有关。2.核酸研究是现代生物医学研究的核心。,第二节、核酸的组成,二、核酸的类别、分布和组成（一）、类别：核酸(nucleic acid)分为:脱氧核糖核酸(DNA,deoxyribonucleic acid)与核糖核酸(RNA,ribonucleic acid)。核糖核酸（RNA）分成以下几类：1、信使RNA（mRNA）2、转移RNA（tRNA）3、核糖体RNA（rRNA）4、其他的非编码RNA(snRNA,microRNA),（二）、核酸的分布：1、DNA的分布：真核生物细胞核，线粒体亦含有DNA.原核生物集中于核区，核外的质粒病毒含有DNA或RNA.2、RNA的分布 存在于细胞质和细胞核中。发现了许多新的具有特殊功能的RNA：如反义RNA，核酶等.病毒和亚病毒RNA有许多种：正链RNA、负链RNA病毒、类病毒、卫星病毒等.,（三）核酸的组成,1.组成的基本单位:核苷酸2.组成元素:C、H、O、N、P,RNA为D-核糖，DNA为 D-2-脱氧核糖，二者都是 型。差别：2 位羟基是否脱氧。,（1）核酸中的糖,（2）碱基：a、嘌呤碱：腺嘌呤（Ade)、鸟嘌呤(Gua)b、嘧啶碱：胞嘧啶(Cyt)、尿嘧啶(Ura)、胸腺嘧啶(Thy),（3）核苷：戊糖与碱基通过-糖苷键相连，CN糖苷键。糖C1与嘧啶碱N1与嘌呤碱N9相连，碱基与糖环垂直。根据核苷中所含戊糖的不同，分为核糖核苷和脱氧核糖核苷。核酸分子中的碱基或核苷酸的修饰非常常见，如DNA的甲基化，RNA的转录后修饰。,（4）核苷酸,一切生物的遗传物质核酸,核酸,脱氧核糖核酸（DNA）,核糖核酸（RNA）,主要在细胞核的染色体上，少数在线粒体和叶绿体,主要在细胞质中,脱氧核糖核苷酸,核糖核苷酸,五碳糖：脱氧核糖,碱基：,磷酸,A、G、C、T,脱氧核糖,碱基,磷酸,A,腺嘌呤,G,鸟嘌呤,脱氧核糖核苷酸,C,胞嘧啶,T,胸腺嘧啶,五碳糖：核糖,碱基：,磷酸,A、G、C、U,核糖,碱基,磷酸,A,腺嘌呤,G,鸟嘌呤,核糖核苷酸,C,胞嘧啶,U,尿嘧啶,一、核酸的一级结构（一）核酸中核苷酸的连接方式DNA、RNA中的脱氧核苷酸、核苷酸是通过3，5 磷酸二酯键连接的。表示方法：书写顺序53。核酸的一级结构是指核酸分子中各核苷酸残基以磷酸二酯键连接、沿多核苷酸链排列的顺序。,第三节、核酸的结构,核苷酸的组成与连接,DNA的一级结构图示,（二）一级结构的表示方法,（1）线条式：竖线碳链、碱基、磷酸,（2）文字式：5ppppppppp3DNA5ppppppppp3RNA此式可进一步简化为：5353,2、一级结构特点 DNA的相对分子量非常大，能编码的信息量十分巨大。细菌的基因是连续的,无内含子功能相关基因组成操纵子，有共同的调控序列，较少重复序列。真核生物的基因是断裂的，有内含子功能相关基因不组成操纵子，调控序列占比重大，有较大重复序列,又分为高度重复、中度重复、单一序列。此外还有回文结构.越是高等的真核生物其调控序列和重复序列的比例越大。,1、DNA的一级结构DNA的一级结构A、T、G、C通过3，5-磷酸二酯键连接，C1碱基，C2脱氧。碱基：A、T、G、C；脱氧核糖；没有侧链,二、DNA的二级结构（1）、模型建立的依据：Chargaff等科学家用纸层析及紫外分光光度技术分析了各种生物的DNA的碱基组成。结果显示：摩尔数 A=T；G=C；A+C=G+T；A+G=C+T,碱基之间形成氢键模型,双螺旋平面图The double helix maintains a constant width because purines always face pyrimidines in the complementary A-T and G-C base pairs.The sequence in the figure is T-A,C-G,A-T,G-C.,（2）DNA双螺旋的特点：A、两条反平行多核苷酸链绕中心轴缠绕，右手螺旋；B、骨架：内侧碱基垂直于纵轴；外侧-磷酸与戊糖、彼此通过3、5磷酸二酯键，糖环平面与纵轴平行。大沟宽1.2nm，深0.85nm；小沟宽0.6nm，深0.75nm；C、直径：2nm，二相邻碱基高度0.34nm，二核苷酸夹角36度，旋转一周10个核苷酸，一周高度3.4nm；,三、DNA的三级、四级结构：细长的分子以一种高度压缩状态存在于细胞中，双螺旋的进一步扭曲就构成了三级结构。超螺旋，三级结构中的一种。DNA压缩总原则：多级螺旋，4级压缩。,真核,基因A,基因B,基因区间,四、RNA分子的结构与功能（一）、RNA的类别1 信使RNA(messenger RNA,mRNA);2 转移RNA(transfer RNA,tRNA);3 核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA);,（二）、RNA结构的特点,RNA与DNA结构十分相似，二者相比有几点不同：（1）核糖：（2）碱基：A、G、C、U（3）二者在三维结构上的区别RNA不具有规则的氢键结构，单链形式存在，只是回折，局部配对，不配对形成突环。,1、mRNA,5Cap的功能：,3 Poly A 的功能：,Ala的tRNA结构示意图,2、tRNA：转运氨基酸,tRNA有“接头”(adaptor)功能，具备双重特性；识别氨基酸其 3末端的腺苷酸可与一氨基酸共价连接识别密码子反密码子与mRNA中的密码子碱基配对。,6、rRNArRNA占RNA总量的80%以上，核糖体由大小两个亚基组成，大小亚基分别几种rRNA和数十种蛋白质组成。rRNA与几十种蛋白质组成的细胞颗粒核糖体是细胞内合成蛋白质的工厂。核糖体上催化肽键合成的是rRNA，蛋白质只是维持rRNA的构象，起辅助作用。,转录,翻译,场所：核糖体,场所：细胞核,其他RNA的结构与功能,不均一核内RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)：hnRNA是mRNA的未成熟前体。细胞内有小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spilceosome)的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。核仁小分子RNA(snoRNA)负责rRNA加工(切割和修饰)由内含子编码。染色质RNA(chromosome RNA),稳定基因组DNA的作用。,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,第二节 基因组DNA的分离纯化,第三节 质粒DNA的提取与纯化,第四节 RNA的分离纯化,第二章、核酸分离技术,第五节 核酸的保存与鉴定,1、保持核酸分子结构的完整性；2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度；应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,一、核酸分子提取的技术路线,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,（一）核酸的释放,（二）核酸的分离与纯化：,应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子 时，其它的核酸分子皆为杂质；3、加入的有机溶剂和某些金属离子,（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤,沉淀是浓缩核酸的最常用的方法常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除,二、技术路线的设计,核酸的提取过程,基因组DNA的特点：1.分子大，容易断裂 2.容易污染其它来源的DNA分离纯化方法：1.酚抽提法2.甲酰胺解聚法3.玻棒缠绕法4.异丙醇沉淀法,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,DNA酚抽提法示意图,一、酚抽提法,基因组DNA的提取-酚抽提法,样品的准备,细胞的裂解,蛋白质变性,DNA的抽提,DNA的沉淀,血基因组DNA试剂盒,酵母基因组DNA试剂盒,细菌基因组DNA试剂盒,细胞基因组DNA试剂盒,DNA柱层析法示意图,第三节 质粒DNA的提取与纯化,质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形形色色的细菌类群中发现质粒这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。,质粒特性,1.分子相对小 2.含有高效的自主复制成分 3.不相容性4.转移性5.选择的标记6.限制性内切酶单一切。,质粒DNA的提取和纯化,1细菌的培养 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。,质粒DNA的小量制备 2-5ml质粒DNA的大量制备 500ml,2细菌的收集,细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净,碱裂解法 煮沸法 SDS裂解法 Triton-溶菌酶法,3细菌的裂解,方法,4质粒DNA的提取,-适用于大质粒DNA,-不适宜含糖高的菌株如HB101,选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）设置专门RNA移液装置；使用蛋白酶K和阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠;准备溶液或缓冲液时，使用无RNA酶的器皿,DEPC处理水等;,一、RNA制备的条件与环境,第四节 真核细胞RNA的分离纯化,细胞RNA的含量,每个细胞的RNA量约为10-5 g 80%-85%rRNA 10%-15%tRNA 1%-5%mRNA 其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA,核酸的鉴定浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定核酸的保存DNA的储存RNA的储存,第五节 核酸的鉴定与保存,一、核酸的浓度鉴定,（1）紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。DNA或RNA的定量，OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸,浓度鉴定,紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。如计算DNA浓度 A260稀释倍数50 g/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。,(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20 g/ml单链寡核苷酸）,荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激 发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）,3.DNA 分子片断的测定,应用凝胶电泳可以正确地测定DNA片段的分子大小。电泳完毕后，经澳化乙锭染色，照相，从照片上比较待测样品中的DNA片段与标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段的大小。,紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与降低均提示不纯。判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,二、核酸的纯度鉴定,纯DNA 比值1.8，1.8 Pr、苯酚污染纯RNA 比值2.0，2.0 DNA、Pr、苯酚污染,荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。,DNA的完整性测定：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。,三、核酸的完整性鉴定,DNA片段的降解,质粒DNA的完整性测定：,完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA的污染。,三（2）RNA的完整性测定：,总RNA电泳图谱,正常时，28S RNA的荧光强度约为18S RNA的2倍，否则提示RNA的降解,1、短期贮存：4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2、长期贮存：TE缓冲液中-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。,（二）核酸的保存,-DNA的储存,RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70保存。注意避免Rnase 的污染；分装，避免反复冻融；如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin或VRC，保存时间可延长。,2、RNA的储存,格里菲斯的细菌性状转变实验,肺炎双球菌,S型有致病力,R型无致病力,老鼠死亡血液中分离出S型菌,老鼠存活血液中分离不出R型菌,格里菲斯的细菌性状转变实验,活的S型菌,活的R型菌,死的S型菌,活的R型菌,加热杀死的S型菌,活的S型菌,艾佛瑞证实了DNA促使细菌转型,取出萃取物,1.DNA分解酶,2.RNA分解酶,3.蛋白质分解酶,假设：S型菌具有某种物质促使R型菌发生转型,S型菌,R型菌,R型菌,R型菌,R型菌,S型菌,S型菌,赫雪、蔡斯证实了DNA为遗传物质,以T2噬菌体和大肠杆菌作为材料；目的：欲知是何种物质可作为噬菌体的遗传物 质，DNA？还是蛋白质外鞘？利用放射性同位素：35S标定噬菌体蛋白质 32P标定噬菌体DNA,蛋白质外鞘,DNA,噬菌体侵染细菌的实验,多基因表型:肤色,多基因表型:身高,数量性状多基因表型,核酸遗传的物质基础,基因是所有生物体遗传信息的载体，是决定生老病死等所有现象的基本元素。基因的物质基础是核酸分子。,人类的健康是受内因和外因共同的影响。,外因：个体的外在因素 60%,内因：个体的遗传因素决定 40%,所有疾病的发生都与基因密切相关,核苷酸的基本构造,MonophosphateDiphosphateTriphosphate,AdenineGuanineThymineCytosineUracil,Nucleoside(Adenosine),Nucleotide(Adenosine monophosphate,AMP),核苷,核苷酸,磷 酸,五环糖,碱基,高速捣碎法：将组织加盐水(约1312)装入捣碎机桶内。用10 000 rmin间断离心，每次3060 s，防止离心时间过长产生的热破坏抗原活性。,高速组织捣碎机,高速捣碎法,玻璃匀浆器,研磨法用玻璃匀浆器。主要经过旋转、挤压等方式将组织粉碎。用此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，对大分子的破坏也少。该法可用于粉碎少量软嫩材料（脑、胰、肝等）时常用的方法。,玻璃匀浆器,常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等,酶处理法,方法：在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞。,特点：此法适用多种微生物；具有作用条件温和；内含物成分不易受到破坏；细胞壁损坏的程度可以控制。,原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。,表面活性剂处理,常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。,应用：破碎细菌，且作用比较温和；提取基因组或质粒DNA的常用破碎方法。,各种碱基的紫外吸收光谱,EB与DNA的结合,核酸的理化性质,DNA样品准备,常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等；需要对样本进行预处理；生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70或液氮。,EDTA的作用：二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。SDS的作用：溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对RNA、DNA酶有抑制作用；与蛋白质形成R-O-SO3.R蛋白质复合物，使蛋白质变性。,细胞的裂解,蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。,蛋白质变性,DNA的抽提,酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。,DNA的沉淀,1.无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。2.异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子。,应用溴化乙锭一氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA,RNA及蛋白质分开。这个方法是目前实验室中纯化质粒DNA时最常用的方法。如果应用垂直转头，每分钟65000转（Beckman L一70超离心机），只要6h可以完成分离工作。但是如果采用角转头，转速为每分钟45 000转时，则需16h。离心完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫外光照射下显示得一清二楚（图15一2),蛋白质漂浮在最上面，RNA沉淀在底部，超螺旋DNA沉降较快，开环及线型DNA沉降较慢。,5质粒DNA的纯化,