核酸的分离纯化.ppt
第五章 核酸的分离纯化,温州医学院 彭 颖,DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象DNA和RNA的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作,第五章 核酸的分离纯化,核酸分离纯化的原则:保持核酸一级结构的完整性尽可能提高核酸制品的纯度,第五章 核酸的分离纯化,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,第二节 基因组DNA的分离纯化,第三节 质粒DNA的提取与纯化,第四节 RNA的分离纯化,第五章 核酸的分离纯化,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,一、材料与方法的选择,二、技术路线的设计,三、核酸的鉴定与保存,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,一、材料与方法的选择,（一）材料与方法的选择,（二）选择原则,（一）材料与方法的选择,不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案,一、材料与方法的选择,1.保持核酸碱基序列的完整性 2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3.保持核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏,（二）选择原则,一、材料与方法的选择,二、技术路线的设计,（一）核酸的释放,（二）核酸的分离与纯化,（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤,（一）核酸的释放,DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。,二、技术路线的设计,应该清除的杂质主要包括:1.非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等 2.非需要的核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子,（二）核酸的分离与纯化,二、技术路线的设计,（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤,沉淀是浓缩核酸最常用的方法常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除,二、技术路线的设计,三、核酸的鉴定与保存,（一）核酸的鉴定,（二）核酸的保存,（一）核酸的鉴定,1.浓度鉴定,2.纯度鉴定,3.完整性鉴定,三、核酸的鉴定与保存,紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。,1.浓度鉴定,三、核酸的鉴定与保存,各种碱基的紫外吸收光谱,三、核酸的鉴定与保存,荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在 UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。,三、核酸的鉴定与保存,EB与DNA的结合,三、核酸的鉴定与保存,紫外分光光度法：主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。,2.纯度鉴定,三、核酸的鉴定与保存,1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品:OD260/OD280=1.8 RNA纯品:OD260/OD280=2.0,三、核酸的鉴定与保存,荧光光度法：EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。,三、核酸的鉴定与保存,琼脂糖凝胶电泳：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状,3.完整性鉴定,三、核酸的鉴定与保存,DNA的降解,三、核酸的鉴定与保存,完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度应呈特定的比值。沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低,三、核酸的鉴定与保存,28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染,三、核酸的鉴定与保存,三、核酸的鉴定与保存,（二）核酸的保存,1.DNA的储存,2.RNA的储存,三、核酸的鉴定与保存,溶于TE缓冲液中的DNA在-70冰箱可保存数年。TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时DNA易变性。,1.DNA的保存,（二）核酸的保存,三、核酸的鉴定与保存,2.RNA的保存,三、核酸的鉴定与保存,RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70 保存 RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延长保存时间 用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,一、酚抽提法,二、甲酰胺解聚法,三、玻棒缠绕法,四、其它方法,五、DNA片段的纯化,六、DNA片段的回收,一、酚抽提法,1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提，获得DNA粗制品,一、酚抽提法,二、甲酰胺解聚法,1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。,三、玻棒缠绕法,玻棒缠绕法是在Bowtell(1987)方法的基础上经改进而来,四、其它方法,有些分子诊断技术并不需要高分子量的DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法广泛使用。1.异丙醇沉淀法 2.玻璃珠吸附法,五、DNA片段的纯化,常用的纯化方法：有机溶剂抽提法 柱层析法（column chromatography）,五、DNA片段的纯化,六、DNA片段的回收,原则与要求:1.提高片段的回收率 2.清除回收的DNA样品中的杂质,六、DNA片段的回收,（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段,（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段,1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法2.电泳洗脱法3.冷冻挤压法4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法,（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段,六、DNA片段的回收,（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段,标准方法是压碎与浸泡法。费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。,六、DNA片段的回收,第三节 质粒DNA的提取与纯化,第三节 质粒DNA的提取与纯化,二、煮沸裂解法,三、SDS裂解法,四、其他方法,一、碱裂解法,五、质粒DNA的纯化,一、碱裂解法,在强碱（pH12.012.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。,一、碱裂解法,细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋结构在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中,一、碱裂解法,二、煮沸裂解法,将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。,二、煮沸裂解法,质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,然后回收上清液中的质粒DNA,三、SDS裂解法,将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁用SDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA,三、SDS裂解法,由于条件温和，SDS裂解法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但由于部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。,四、其他方法,（二）牙签少量制备法,(一)小量一步提取法,四、其它方法,(一)小量一步提取法直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析,四、其它方法,（二）牙签少量制备法用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定,五、质粒DNA的纯化,.CsCl-EB法.聚乙二醇沉淀法.柱层析法,在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。蛋白质由于密度小而浮于液面RNA密度大而沉于管底各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部,五、质粒DNA的纯化,EB-CsCl密度梯度离心法,五、质粒DNA的纯化,不同分子构型的DNA与EB的结合能力不同，密度下降也不同，因而可将它们有效分离开。染色体DNA、开环质粒DNA等可嵌入更多的EB，因而密度下降较多 闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入而结合量少，密度下降较少,五、质粒DNA的纯化,五、质粒DNA的纯化,第四节 真核细胞RNA的分离纯化,第四节 真核细胞RNA的分离纯化,二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法,三、商品化试剂单相裂解法,四、mRNA的分离纯化,一、RNA制备的条件与环境,一、RNA制备的条件与环境,RNA易被RNase水解，RNase除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复,一、RNA制备的条件与环境,去除RNase的污染和抑制其活性是RNA制备成功与否的关键在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活细胞内RNase的活性,选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）使用蛋白酶K 使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠,一、RNA制备的条件与环境,联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解加入-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活,一、RNA制备的条件与环境,二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法,以含异硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞在pH4.0的条件下，酚/氯仿抽提细胞裂解溶液通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA,二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法,总RNA产量取决于标本的起始量，每mg组织大约能制备47g总RNA，每106个细胞大约能制备410g总RNA。,三、商品化试剂单相裂解法,是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相,三、商品化试剂单相裂解法,变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备,三、商品化试剂单相裂解法,目前，该法已成为实验室最常用的总RNA提取法，其产量及质量与酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法相当。,四、mRNA的分离纯化,除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端带有长短不同的poly（A）尾巴利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA,1.oligo（dT）-纤维素柱层析法2.oligo（dT）-纤维素柱离心法3.oligo（dT）-纤维素液相结合离心法4.磁珠分离法,四、mRNA的分离纯化,四、mRNA的分离纯化,
