多聚酶链式反应扩增DNA.ppt
DNA多聚酶链式反应扩增DNA片断,课题2,1、多聚酶链式反应的概念,一、课题背景,2、多聚酶链式反应的应用：的诊断、和DNA 等各方面。,遗传疾病,刑侦破案,古生物学,基因克隆,序列测定,1、DNA分子的组成成分和结构,DNA 分子的基本组成单位是.共有 种,每个基本单位是由一分子的、一分子的、和一分子的 构成。,脱氧核甘酸,4,磷酸,碱基,脱氧核糖,？,那么DNA分子的平面结构怎样呢？,二、基础知识,2、DNA分子复制的过程,解旋酶,DNA母链,4种脱氧核苷酸,DNA聚合酶,引物（RNA）,打开DNA双链,模板,合成子链原料,催化子链合成,使DNA聚合酶能从引物3端开始连接脱氧核苷酸,思考：3、体内DNA复制的条件是什么？体外扩增DNA 如何提供相似环境？,变性（80-100）,Taq聚合酶（耐高温）,2030个核苷酸构成DNA或RNA,DNA双链,单链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,4、DNA 分子的热变性原理：,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物和引物与两条单链的结合,（一）、PCR技术的原理,利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：子链的5端向 3端延伸。,（一）、PCR技术原理,（二）、PCR的反应过程,每个循环包括：变性 复性延伸,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,DNA双链反向平行,3,5,5,3,1、DNA分子的3 端与5 端-OH端为3;磷酸基团的末端为5。2、DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。,基本单位,3,3,5,5,实验操作步骤：（准备）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（移液）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（混合）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（离心）将微量离心管放在离心机上（反应）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序,反应周期,高温变性,低温复性(退火),适温延伸,反应循环数：,扩增倍数：,109以上,30多次,以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率,（二）、PCR的反应过程,1、循环之前的一次预变性,2、PCR 一般要经历三十多次循环,变性,复制过程,（1）变性：当温度上升到90 以上时，双链DNA解聚为单链。（2）复性：温度下降到50 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。（3）延伸：温度上升到72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。,（二）、PCR的反应过程,3、每个循环包括：变性 复性延伸,（1）PCR循环-变性,95变性,（1）PCR循环-变性,95变性,（1）PCR循环-变性,95变性,（2）PCR循环复性,55复性,（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,4、循环特点：,上一次循环的产物为下一循环的模板 结果单链中有最初母链的只两条（无引物存在于两个子代DNA分子中 其它子代DNA分子都为双引物分子式 处于两引物之间的DNA序列呈指数增长12N,三、实验步骤：,准备好PCR反应体系的配方,四、操作提示：,操作提示 1为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。2PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。,目的：,避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。,五、结果分析与评价,1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。,注意事项：详见操作提示,五、结果分析与评价,DNA 含量的测定：稀释对照调零测定计算（公式见P63）,波长260nm处读数,蒸馏水做对照,50倍,实验结果与分析,DNA含量(ug/mI)=50（260nm的读数）稀释倍数,六、课题延伸,1、PCR优点：2、PCR技术的应用P58,原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作,PCR技术与体内DNA复制的区别：,1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；,2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而其他生物体内的聚合酶在高温时会变性；,3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。,练习(课堂检测),1、DNA单链的_末端为3端,_末端为5端,在DNA复制时,引物从模板链的_端配对结合.在_酶的作用下,从引物的_端,使子链向下延伸.2每次循环可以分为_这三个过程,对应温度分别为_.,磷酸基团,羟基,羟基,DNA聚合,3/,变性、复性、延伸,95、55、72,90以上、50左右、72 左右,练习(教材P63),1、一个DNA片段经过30次循环后能形成_个这样的片段.2、依据DNA吸收紫外光的情况,用紫外分光光度计测得DNA=_,230,50 x(260nm的读数)x稀释倍数,练习巩固,1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定,2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？,3、PCR技术最突出的优点是A 原理简单 B 原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作,子链的5端向 3端延伸,4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染C 高压灭菌 D 在-20 储存,再见,移液器,返回,离心管,返回,离心机,返回,PCR仪,返回,
