固相析出分离法.ppt

第五章 固相析出分离法,目的：浓缩；初步纯化；将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。,概述,固相析出分离法：生化物质目的物经常作为溶质存在于溶液中，改变溶液条件，使它以固体形式从溶液中分离的操作技术。,固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。,固相析出法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。优点：操作简单、经济、浓缩倍数高缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强,盐析法 有机溶剂沉淀法固相析出法 等电点沉淀法 结晶法 其它多种沉淀法,结晶法：析出物为晶体。沉淀法：析出物为无定形固体。,固相析出法分类,第一节 盐析法第二节 有机溶剂沉淀法第三节 其它沉淀方法第四节 结晶,第一节 盐析法,一、基本原理二、影响因素三、盐析操作,定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高；沉淀含大量盐析剂，要除盐；产生氨的恶臭,7,两种现象：盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小,8,2023/9/24,南京农业大学 生命科学学院,9,2023/9/24,南京农业大学 生命科学学院,10,一、基本原理,11,盐析作用（salting out）原理,破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。,破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。,logS=-KsS蛋白质溶解度，g/L；盐离子强度,Cii离子浓度，mol/L；Zii离子化合价；常数,为纵坐标上的截距;Ks盐析常数。,13,盐析和KS盐析,右图示：盐离子浓度与蛋白质溶解度关系曲线，在盐析区，符合公式,两种类型：（1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。（2）在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作盐析法。由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，后期分离（结晶）,14,二、影响盐析的因素,1.无机盐的种类,在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱阴离子盐析效果：柠檬酸PO43-SO42-CH3COO-Cl-NO3-SCN-阳离子盐析效果：NH4+K+Na+高价阳离子阴离子的影响大于阳离子,盐析用盐的选择盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济,盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂（1）价廉；（2）溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，（4）不易引起蛋白质变性。,缺点：（1）水解变酸；（2）高pH 释氨，腐蚀；（3）残留产品有影响。,不同种类蛋白质所需的无机盐量不同先后加入不同量无机盐分级沉淀蛋白质,2.溶质（蛋白质等）种类：Ks、,不同蛋白溶解度与离子强度的关系,盐析分布曲线,19,蛋白质浓度不同：所需无机盐用量不同蛋白质浓度高：所需无机盐量少制成品：可适当高浓度，但浓度过高，易共沉淀重叠蛋白分级：适当稀释，共沉淀小，但回收率降低。,3.溶质（蛋白质等）浓度：23%,不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线,无机或稀盐溶液：T蛋白质溶解度高盐溶液：T蛋白质溶解度蛋白质：室温盐析对温度敏感的酶，0C4C,4.温度：,温度对溶解度的影响,5.pH：,Pl盐析注意高盐下pl的偏移：与负离子结合向低pH偏移，与正离子结合向高pH偏移利用蛋白质pl的不同：可分级沉淀蛋白质,三、盐析操作,1.盐析用盐的浓度表示,硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。,盐析用盐量的表征-饱和度：,饱和度（Saturation）的概念：以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和浓度是767g/L定义为100%饱和度目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于 0.l mgL，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。,调整硫酸铵溶液饱和度计算表,盐析方法：1）分步盐析法(不同的盐浓度)2）重复盐析法高蛋白质浓度下共沉淀重复盐析提高纯度3）反抽提法(相同盐浓度),2、盐析方法和注意事项,分级盐析法不断提高盐浓度：不同蛋白质分级沉淀低饱和度：除杂蛋白，高饱和度：沉淀目的物,单酶盐析曲线,双酶盐析曲线,反抽提法共沉淀较低浓度盐溶液溶杂蛋白,大肠杆菌RNA聚合酶的制备,防止“局部过浓”：慢加，搅拌温度：不宜过低，室温1025C，易失活：010C时间：沉淀需经一段老化时间（1小时）后分离,注意事项：,第二节 有机溶剂沉淀法,一、基本原理二、影响沉淀效果的因素,概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。,优点：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）溶剂易除去3）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；缺点：1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高，需防火防爆总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。,一、基本原理,1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。脱水作用比静电作用强,一些溶剂的介电常数,35,二、影响沉淀效果的因素,1.有机溶剂种类及用量能与水无限混溶介电常数小、沉淀强变性小毒性小，挥发性适中,常用：乙醇、丙酮（挥发肝毒性着火点低）和甲醇（口服毒性）介电常数：无水乙醇24，甲醇33，丙酮22乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；用量：（了解）,2.pH的影响Pl附近、稳定性控制溶液pH时务必使溶液中大多数蛋白质分子带有相同电荷，勿使目的物与杂质带异电荷导致共沉淀。,严格控制低温 有机溶剂与水混合时产生放热反应预冷（有机溶剂-10以下，蛋白质0左右），在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓变性，并散热。温度影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。,3.温度,低浓度缓冲液（），0.2mol/L）：盐溶，增大蛋白质在有机溶剂水溶液中的溶解度，会增加溶媒用量，沉淀物中可能夹带盐，需除盐常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。,4.无机盐的含量,5.某些金属离子的助沉淀作用,Zn、Cu等与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，而活性不变，有助于沉淀，降低有机溶剂用量。胰岛素精制：,6.样品浓度,较稀：溶剂量，收率，稀释变性较高：共沉淀，分辨率，溶剂量，回收率，变性小蛋白质初浓度：0.5%2%粘多糖：12%,举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究-淀粉酶（米曲霉）菌体+水 过滤 水抽提清液 加乙醇（70%）搅拌-淀粉酶,*pH影响 收率%酶活 收率 酶活 6.5 pH*适宜的pH 5.6 6.0,*温度影响 收率%酶活 酶活 收率 10 20 T*适宜的温度10 20,第三节 其它沉淀方法,一、等电点沉淀二、成盐沉淀法三、亲和沉淀四、高分子聚合物沉淀法五、表面活性剂沉淀法,一、等电点沉淀法原理：Pl时分子表面静电荷为零，双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。,常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。主要：去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。,二、成盐沉淀法,1.金属离子沉淀所用的金属离子，包括Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等。蛋白质和酶分子中因为含有羟基、氨基、咪唑基和硫氢基等，均可以和上述金属离子作用形成盐复合物。分离沉淀复合物分解除金属离子（离子交换或金属螯合剂EDTA）,应用：目的蛋白分离，去杂质缺点：有时复合物分解较困难，蛋白质易变性,2.有机酸类复合盐 含氮有机酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。工业上用此法制备蛋白质时，需采取较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。,单宁：结合后牢固，竞争结合法分解雷凡诺：不影响蛋白质活性三氯乙酸（TCA）：变性，除杂蛋白,雷凡诺,猪心提取液 洗脱液 上清液 上清 细胞色素C 沉淀（去除）,吸附,人造沸石,盐析,45%饱和硫酸铵,沉淀,TCA,透析,三、亲和沉淀法,配基+可溶性载体偶联成载体-配基复合物（亲和沉淀剂）可选择性地与蛋白质结合而沉淀出来,它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。,亲 和 沉 淀 过程,亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的有效方法。初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配位体络和形成沉淀；所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。,四、高分子聚合物沉淀法,水溶性非离子型高分子聚合物能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。PEG、壬苯乙烯化氮（NPEO)、葡聚糖双水相或单高聚物其中应用最多的是聚乙二醇。无毒，对产品的影响小，但不易除去,56,五、表面活性剂沉淀法,CTAB（十六烷基三甲基季胺溴化物）、CPC(十六烷基氯化吡啶)：沉淀酸性多糖与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。SDS：分离胰蛋白或核蛋白目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。,讨论：咸鸭蛋煮熟了，蛋黄里会有油，这是什么缘故？,熟鸭蛋蛋黄中脂肪的含量高达31，为什么看不到一点油？可是在熟咸蛋的蛋黄中，却经常可以看到黄色的油滴往外流？,蛋黄中除了脂肪以外，还含有丰富的蛋白质，蛋白质就是一种高明的乳化剂，它能够把蛋黄中的脂肪分散成很小的油滴，这样就骗过了我们的眼睛和舌头。在盐渍过程中，作为乳化剂的蛋白质被盐析出来，乳浊液被破坏了，那些原来分散成极小的油滴，彼此就互相聚集起来，变成大油液，使得整个蛋黄变成油滋滋的，甚至流出油来了。,第四节 结晶,定义：溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母液中，经过滤、洗涤可得到纯度高的晶体。,一、结晶过程二、过饱和溶液的形成三、提高晶体质量的途径,饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；溶质只有在过饱和溶液中才能析出；,一、结晶过程,1.概念,推动力：形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。晶核：最先析出的微小颗粒是以后晶体的中心，称为晶核。首先形成晶核，微小的晶核具有较大的溶解度。实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成溶解再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在。,2.晶体的形成,结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。条件：,过程：形成过饱和溶液晶核形成晶体生长,3.结晶曲线,稳定态：不沉淀结晶亚稳定态：不自动生产结晶，加入晶体能诱导结晶。控制条件，让晶体缓慢长大。不稳定态：自动沉淀结晶，大量细小结晶,结晶操作通常都在亚稳区中进行,4.起晶方法,自然起晶 把溶液蒸发浓缩至过饱和区（不稳定区），则有大量晶核自然形成。但晶核数量难以控制，晶粒小。,刺激起晶把溶液蒸发至接近过饱和线后把溶液放出，使溶液突然冷却，进入过饱和区形成大量晶核。当晶核达到一定数量后，回升温度，使溶液进入介稳区，停止晶核产生，然后再慢慢冷却，同时搅拌，使晶核长大。,晶种起晶将溶液浓缩到介稳定区的饱和浓度后，加入一定大小和数量的晶种，同时均匀搅拌，使晶体长大。优点：控制方便，产品晶体大小均匀。,二、过饱和溶液的形成（结晶方法）,1.蒸发法蒸发除去部分溶剂，在常压或减压下加热除去一部分溶剂，以达到或维持过饱和度。适用于小分子化合物的结晶，受热变性的蛋白质或酶类不宜采用。,2.温度诱导法,通过升高或降低温度，使溶液逐渐达到饱和，可缓慢析出晶体。热盒技术耐热生化物质高温溶解温度逐渐下降析出晶体,3.盐析结晶法固体盐粉末、饱和盐溶液（中性盐）蛋白质及酶类药物制备中常用方法,4.透析结晶法,72,使溶解度的变化连续又缓慢,5.有机溶剂结晶 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、异丙醇、乙腈、2、4二甲基戊二醇（MPO）等。蛋白质变性 溶剂回收6.等电点结晶,7.微量扩散法,通过气相扩散使样品中溶质达到饱和晶体,8.化学反应结晶法,调pH或加反应剂生成新物质结晶,其实质是利用化学反应，对待结晶的物质进行修饰，一方面可以调节其溶解特性，同时也可以进行适当的保护；,9.共沸蒸馏结晶,共沸物的共沸点真空下共沸点真空低温下进行共沸蒸馏结晶常多种方法综合应用,工业上通常希望得到粗大而均匀的晶体，便于过滤与洗涤。晶体质量包括三个方面的内容：晶体大小、形状和纯度,三、提高晶体质量的途径,1）过饱和度过饱和度值应大至使结晶操作控制在亚稳区内，又保持较高的晶体生长速率，使结晶高产而优质。2）温度（缓慢冷却）,1.晶体大小,3）搅拌速度：适当，不宜太快,搅拌的作用:加速溶液的热传导，加快生产过程。加速溶质扩散过程的速率，有利于晶体成长。使溶液的温度均匀，防止溶液局部浓度不均，结垢等。使晶核散布均匀，防止晶体粘连在一起形成晶簇，降低产品质量。,4）晶种：诱导结晶，控制晶体形状大小均匀度,2.晶体形状,晶体生长速度过饱和度溶剂pH：pH的变化，可以改变溶质分子的带电性质，是影响溶质分子溶解度的一个重要因素。一般结晶液所选用的pH 与沉淀大致相同。杂质,3.晶体纯度,母液中的杂质晶体越细小，杂质越多洗涤有利提高纯度结晶速度过快，易产生“晶蔟”，包含杂质,杂质对晶体的成长速率的影响较为复杂，有的杂质能抑制晶体的成长，有的能促进成长，有的能改变晶型。,4.晶体结块,原因：粒度不齐、空气湿度高、温度高、受压、贮存时间增长措施：控制粒度分布、良好外形、干燥密闭容器贮存,5.重结晶,晶体用合适溶剂溶解后再次结晶，提高纯度用于生物物质重结晶的溶剂一般有蒸馏水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低级醇等。,结晶是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的一种有效手段。变性蛋白质不能结晶，所以凡结晶状态的蛋白质都能保持天然状态。,2023/9/24,南京农业大学 生命科学学院,84,2023/9/24,84,南京农业大学 生命科学学院,谷氨酸结晶,固相析出法的应用,例1：尿激酶的沉淀分离,尿激酶：分离方法包括沉淀法、吸附法、层析法沉淀法：金属离子形成复合盐脱盐盐析,Zn 离子沉淀尿激酶,低浓度时，zn 能选择沉淀尿激酶。在3mM可得85-92 回收率，而沉淀物的量并不多；加大Zn 浓度虽然能提高有限回收率，但沉淀物量大，纯度降低。,沉淀量,酶活,EDTA 溶出效应,硫酸铵溶解尿激酶锌络合物,硫酸铵的选用1)它在低浓度时可能有盐溶作用，促进沉淀蛋 白溶解；2)因为本身有NH4+，与Zn 2+有络合作用，有 利于沉淀物溶解；3)硫酸铵为盐析所用，在最终盐析中，只需补 加规定量即可，而不引入其他成分。,尿激酶盐析沉淀,沉淀量 回收率 纯度,例2：柠檬酸的生产,柠檬酸是一种重要的有机酸，它在食品、医药、化工、皮革、环保等工业部门都有广泛的用途。目前柠檬酸极大多数是通过微生物发酵法（黑曲霉）生产，提取工艺中，目前大多通过沉淀法制备（碳酸钙沉淀及硫酸酸解）,标准沉淀法回收柠檬酸流程图,加热到70度,pH1.82.0,过滤,例3：胰蛋白酶的提取,从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下稳定溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（pI10.8)浓缩分离胰蛋白酶原（盐析）溶解激活（酶原-酶）胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白等与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同,胰蛋白酶的提取,（二）胰蛋白酶原激活滤饼溶解,加入无水CaCl2,边加边搅拌,最终含有0.1M CaCl2；5MNaOH调pH至8.0,加极少量胰酶搅拌，于室温下活化810小时；活化完成，用2.5M H2SO4调pH至，抽滤除去CaSO4沉淀。,（一）猪胰蛋白酶原的提取胰脏绞碎加入2倍体积冷乙酸(pH2.5)低温搅拌24小时，过滤；滤液用2.5M H2SO4调pH至2.53.0，放置34小时后，用滤纸过滤；滤液加入硫酸铵,达0.75饱和度放置过夜抽滤，得酶原粗制品。,（三）胰蛋白酶的分离将激活溶液加入固体硫酸铵,达0.4饱和度,数小时后抽滤弃滤饼。滤液加入硫酸铵，饱度达到0.75，放置数小时，抽滤弃滤液，即得胰蛋白酶粗品。,例4：四环素的沉淀提取,四环素由链霉菌发酵获得四环素等电点pI=5。当溶液的pH 等于等电点时，四环素易从水溶液中沉淀出来（游离碱），因此可用于四环素的提取。四环素又能与尿素形成1：1的复盐，从水溶液中沉淀出来，该复盐溶于有机溶剂时，即分解成四环素和尿素。四环素与尿素的这一反应具有特异性：金霉素，土霉素都不能与尿素形成复合物沉淀。利用这一性质，可精制四环素。,四环素发酵液预处理,加草酸酸化至，分别加0.2(w/v)黄血盐、硫酸锌,过滤,滤洗液,发酵液,滤渣 0.5%草酸水顶洗 洗液滤液,第一步沉淀提取,沉淀粗碱,滤液 7000-9000 u/ml,搅拌下慢慢加入浓氨水调pH4.8 10-15，搅拌30min，过滤,第二步沉淀提取,溶于尿素盐酸溶液中（粗碱干重:尿素:水:浓HCl1:2:2:0.25）,粗碱,粗碱尿素溶液,沉淀四环素尿素复盐,丁醇清液,丁醇悬浮溶液,溶于酸性丁醇中复盐干重:丁醇:浓HCl1:10:0.3(丁醇先，搅拌下滴加HCl),滤去不溶物,浓氨水调pH4.64.8搅拌20min，过滤,结晶,思考题,1.沉淀与结晶有何不同？常用的沉淀方法包括哪些？2.何谓盐析？其原理是什么？常用的盐析方法有哪些？影响盐析的主要因素有哪些？盐析操作时常用的盐是什么？3.有机溶剂沉淀法的主要原理是什么？影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？4.什么是结晶？结晶过程包括哪些？在何种条件下，溶液中才有晶体析出？5.提高晶体质量的途径,