发酵动力学实验.ppt

发酵动力学研究的内容研究发酵动力学的方法发酵动力学研究步骤发酵动力学研究的意义发酵动力学模型发酵动力学实验设计,发酵动力学实验,发酵动力学是研究各种发酵过程变量在活细胞作用下的变化规律，以及各种发酵条件对这些变量变化速度的影响。以化学热力学（研究反应的方向）和化学动力学（研究反应的速度）为基础，对发酵过程中各种物质的变化进行描述。,一、发酵动力学研究的内容,研究内容,微生物生长动力学,基质消耗动力学,产物生成动力学,二、研究发酵动力学的方法,发酵动力学研究的前提,反应器内的搅拌系统能保证理想的混合；温度、pH等环境条件能够控制以保持稳定；细胞有固有的化学组成，不随发酵时间和某些发酵条件的变化而发生明显变化；各种描述发酵动态的变量对发酵条件变化的反应无明显滞后。,1.宏观处理法：把细胞看成一个均匀分布的物体，不管微观反应机制，只考虑各个宏观变量之间的关系，这样便得出结构模型和非结构模型2.质量平衡法：根据质量守恒定律，对某一物质在过程发生前后的质量变化进行恒算。,发酵动力学研究方法,质量平衡式,物质在系统中积累的速度=物质进入系统的速度+物质在系统中生成的速度-物质排出系统的速度-物质在系统中消耗的速度,某物质在系统中的含量能够在线测量或估计，通过建立上述平衡方程式，就可以确定该物质在系统中变化的动力学。,人为加入或排出和通过相界面传质进入或排出,三、发酵动力学研究步骤,获得发酵过程中能够反映发酵过程变化的多种理化参数,寻求发酵过程变化的多种理化参数与微生物发酵代谢规律之间的相互关系,建立多种数学模型，描述多种理化参数随时间变化的关系,利用计算机和程序控制，反复验证多种数学模型的可行性的适用范围,氧需求,好氧发酵,兼性好氧发酵,厌氧发酵,液体表面发酵,液体深层发酵,深层发酵,操作方法,分批发酵,分批补料发酵,连续发酵,微生物发酵动力学的研究与发酵的种类、方式密切相关,四、发酵动力学研究的意义,通过对发酵反应动力学的研究，进行最佳发酵生产工艺条件的控制。发酵过程中，菌体的浓度、基质浓度、温度、pH值、溶解氧等工艺参数的控制方案，可以在这研究的基础上进行优化。,设计合理的发酵过程，也必须以发酵动力学模型作为依据，利用计算机进行程序设计、模拟最合适的工艺流程和发酵工艺参数，从而使生产控制达到最优化。,发酵动力学的研究还在为试验工厂比拟放大、为分批发酵过渡到连续发酵提供理论依据。,发酵过程中，基质主要消耗在：满足菌体生长消耗维持微生物生存的消耗合成代谢产物的消耗,S，基质（底物）；G，菌体生长；M，维持代谢；P，产物合成,1、几个基本概念,五、发酵动力学模型,1.维持因数(m)：单位重量的（菌体）细胞在单位时间内用于维持代谢消耗的基质的量。一般来讲指维持细胞最低活性所需消耗的能量。（碳，氮，氧等的维持因数mc,mn,mo）,ms:以基质消耗为基准 的维持因数，X:菌体干重；S:基质量t:发酵时间；M:表示维持。,基质的消耗速度,基质的消耗比速率,2.比速（率）:单位时间内，单位干菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量(消耗的基质用于维持代谢，菌体生长和产物合成)。比速率是生物反应中用于描述反应速度的常用概念,菌体的比生长速率,产物的比生产速率,3.生长得率：菌体的生长量相对于基质消耗量的收得率。,YX/s:相对与基质消耗的实际生长得率系数,Yg/s:相对于基质消耗的（纯生长）理论得率系数,特定的基质及在特定环境条件下培养的特定微生物，它是一个常数，又称最大生长得率或生长得率常数。,4.产物得率：产物的合成相对于基质消耗量的收得率。,YP/s:相对于基质消耗的实际产物得率系数,Yps:相对于基质消耗的产物理论得率系数,理论产物得率取决于产物的生物合成途径，对于由特定基质经特定途径产生的特定产物来说，它是一个常数，不因菌株和发酵条件的不同而异。,：菌体的生长比速 s：单一限制性基质浓度 Ks：半饱和常数max:最大比生长速率,s,1.Monod方程式,2、微生物生长动力学,ks,莫诺方程成立的假设条件：菌体生长为均衡型非结构式生长，细胞成分只需要用一个参数即菌体浓度表示；只有一种底物是生长限制性底物，并且没有反馈抑制性产物出现；微生物生长没有动态滞后性。,Monod方程中单一限制性基质可以是培养基中任何一种与微生物生长有关的营养物，只要该基质相对缺乏，就成为限制性生长因子。实际过程中，可能出现多种限制性基质和抑制性物质，影响了Monod方程的适用性。,Ks，微生物对基质的饱和常数,当=1/2max，s=Ks 当s Ks，基质浓度较高时，与s无关，零级反应。当s趋近于无穷大时，=max.max是理论上最大的生长潜力。,m,m/2,ks,s,米氏方程,m,m/2,ks,s,莫诺方程,莫诺方程与米氏方程 二者形式相同，但微生物生长是细胞群体生命活动的综合表现，机理非常复杂。Monod方程与米氏方程的区别与联系是：Monod方程是对实验现象的总结，是经验方程（empirical model）；米氏方程是根据酶反应机理推导得出，是机理方程（mechanistic model）。,由于微生物的代谢产物，特别是次级代谢产物的合成途径特别复杂，其动力学过程不仅受菌体自身基因型的限制，还与其生活的外部条件有密切关系。目前整个动态变化过程的规律仍不是十分清楚，大多数研究只是限于宏观变量的非结构模型。,3、微生物的产物生成动力学,根据细胞生长与产物形成是否偶联进行分类,Luedeking-Piret模型是一常见的分批发酵产物合成动力学模型，它把产物生成速率看作是菌体生长速率和菌体浓度的函数，用数学式表示为：,式中：与生长偶联的产物形成系数 非生长偶联的相关系数,偶联型：产物生成速率与细胞生长速率有紧密联系，合成的产物通常是分解代谢的直接产物，如葡萄糖厌氧发酵生成乙醇，或者好气发酵生成中间代谢物(氨基酸或维生素)。这类初级代谢产物的生产速率与生长直接有关。式中0，0,混合型：生长与产物生成相关(如乳酸、柠檬酸、谷氨酸等的发酵)，发酵产物生成速率可由Luedeking-Piret模型数学式描述，式中0，0。该混合型模型复杂的形成是将常数、作为变数，它们在分批发酵的四个时期分别具有特定的数值。,根据细胞生长与产物形成是否偶联进行分类,非生长偶联型：在生长和产物无关联的发酵模式中，细胞生长时，无产物，但细胞停止生长后，则有大量产物积累，产物的形成速率只与细胞积累量有关。产物合成发生在细胞生长停止之后(即产生于次级生长)，故习惯上把这类与生长无关联的产物称为次级代谢产物，但不是所有次级代谢产物一定是与生长无关联的。大多数抗生素和微生物毒素的发酵都是非生长偶联的例子，非偶联型发酵的生产速率只与已有的菌体量有关，而比生产速率为一常数，与比生长速率没有直接关系。因此，其产率和产物浓度高低取决于细胞生长期结束时的生物量。式中0，0,根据细胞生长与产物形成是否偶联进行分类,4、微生物的基质消耗动力学,假设发酵过程没有中间代谢产物积累，则含碳基质的质量平衡算式为：消耗的含碳基质=维持代谢消耗量+菌体生长消耗量+产物合成消耗量 即：,微分后：,式中：ms维持系数，即单位菌体、单位时间内用 于菌体维持生命活动的基质量,单纯用于合成单位菌体所消耗的基质量,单纯用于合成单位产物所消耗的基质量,上式反映了基质消耗与菌体生长及产物生成之间的关系。因此，当生长动力学模型和产物生成动力学模型确定后，基质消耗动力学模型即可确定。,六、发酵动力学实验设计,1.实验材料,菌种：雅致放射毛霉AS3.2778培养基：斜面培养基 种子培养基 发酵培养基（参考实验指导）试剂：DNS试剂,2.实验步骤,菌种斜面培养：配制PDA培养基100ml，分装试管，灭菌后摆成斜面，将雅致放射毛霉接种于斜面上，25 培养48h。种子培养：斜面菌种在25恒温培养48h 后，转接于500mL 摇瓶，装液量为150 mL，160 r/min 25，摇床培养16h为种液。,发酵培养:5 L 发酵罐中装入3.5 L 的发酵培养基，培养基在在121 下灭菌30 min，温度降至30 时，接入种液，接种量为4%控制适宜的通气比、保持罐压为0.05 MPa、发酵温度30、搅拌速度160 r/min条件下发酵84h每12 h 取样1 次进行菌体生长量、还原糖产量、蔗糖糖消耗测定结果为3 次重复。,3.分析方法,菌体生物量的测定：采用比浊法，发酵液以蒸馏水稀释，5000 r/min 离心10 min，除去上清液，菌体沉淀用生理盐水洗2-3次再离心去上清液，用生理盐水重悬并进行适当稀释，测定其OD600nm。,还原糖的测定：（1）在碱性条件下，还原糖与3、5二硝基水杨酸共热，3、5二硝基水杨酸被还原为3氨基5硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在722型分光光度计540nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量。,（2）取4支干燥试管,编号,按下表所示的量,精确加入待测液和试剂(ml):,加完试剂后,将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热5分钟，立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水 20.0ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。切勿用力振摇，引入气泡。在540nm波长下，以0号管为空白，在分光光度计上测定出各管溶液的吸光度值。（3）以管1、2、3的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下式计算样品中还原糖的百分含量：还原糖,蔗糖测定：蔗糖经6mol/L盐酸水解转化为还原糖，再按还原糖测定。水解前后还原糖的差值为蔗糖含量。,根据实际情况选择模型方程，由所测得不同时间的菌体生长、基质消耗量和产物形成量画出动力学曲线和计算出动力学方程。,